人参锈腐菌Cylindrocarpon destructans侵染早期人参根尖显微及超微结构变化△

高原，丁万隆，李勇

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

·中药农业·

人参锈腐菌Cylindrocarpon destructans侵染早期人参根尖显微及超微结构变化△

高原，丁万隆，李勇*

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：研究人参锈腐菌Cylindrocarpondestructans接种后人参根尖显微及超微结构的变化情况。方法：采用石蜡切片法研究人参根尖显微结构，透射电镜研究人参根尖超微结构。结果：与对照相比，锈腐菌接种7 d后人参根尖表皮细胞细胞壁明显增厚，表皮细胞内出现颗粒物沉积，部分表皮细胞的细胞壁出现破裂，细胞发生解体，且根内髓部同样出现颗粒物。超微结构观察发现，对照组人参根尖细胞形状规则，内含物丰富，细胞器清晰可辨；接种人参锈腐菌后人参根尖细胞形态异常，细胞内含物减少，细胞器因解体消失而无法辨别。结论：人参锈腐菌可能是先侵染人参表皮细胞，再通过细胞间隙进入木质部，阻碍水分和无机盐运输，导致人参发病死亡。

人参；人参锈腐菌；侵染；显微结构；超微结构

人参PanaxginsengC.A.Meyer为五加科人参属多年生草本植物，主产于我国东北地区，具有抗衰老、抗氧化、增强免疫力等功效，市场需求量巨大。人参栽培周期较长，土传病害发生较为普遍，严重影响人参产量和品质[1-2]。由人参锈腐菌Cylindrocarpondestructans引起的人参锈腐病是人参产区发生最为普遍，危害性最大的病害之一。Rahman和Punja[3]在研究人参锈腐菌侵染寄主时发现，病菌菌丝直接穿透人参表皮细胞并在皮层细胞内生长，随后细胞分解并伴有酚类化合物大量积累。Kim等[4]发现接种人参锈腐菌后，人参会出现细胞壁增厚，以及接种部位周皮损伤的现象。这些研究表明锈腐菌侵染会导致人参内部结构的改变。人参锈腐菌和寄主互作研究主要集中在锈腐菌侵染后人参防御酶的变化[5]，但对于人参锈腐菌的侵染方式以及病菌侵染后人参内部组织、细胞器变化的研究鲜有报道。本研究使用盆栽接种实验，利用光学显微镜和透射电镜，观察人参锈腐菌侵染后人参根尖的显微结构和超微结构变化，旨在明确人参锈腐菌侵染对人参内部组织和细胞形态的影响，为研究人参锈腐菌与寄主植物人参的互作机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1供试材料

植物材料为三年生人参苗，取自中国医学科学院药用植物研究所实验田。致病菌人参锈腐菌Cylindrocarpondestructans由课题组分离、保存。

1.2植物材料接种方法及样品采集

选取三年生健康人参苗，用50%多菌灵800倍稀释液浸泡10min灭菌，再用蒸馏水冲洗3次。将人参苗移栽到装有无菌石英砂的塑料盒中，每盒36株，光周期为16/8h，25℃室温环境下培养，参考李勇等[6]采用Hoagland营养液提供人参苗生长所需养分。待人参苗叶片完全展开后，处理组接种浓度为3.9×107cfu·mL-1的病原菌孢子悬浮液250mL，对照组喷施等量Hoagland营养液。接种1d，4d，7d后分别收集对照组和处理组人参幼根，先用无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干水分备用，每个时间点取10份根尖样品。

1.3石蜡切片制作

用手术刀片切取5mm人参幼苗根尖，将材料置于福尔马林-醋酸-酒精(FAA)中固定2h以上，放置备用。参考陈长宝[7]的方法制作石蜡切片，包埋材料分别纵切和横切，以厚度10μm进行连续切片，依次用番红、固绿对不同部位染色，切片烘干后用Leica DM2500型光学显微镜观察处理组与对照组根尖细胞横切面、纵切面的显微结构，拍照留存。

1.4电镜观察

用手术刀片从对照组和处理组切取1mm3人参幼苗根尖样品，用2.5%戊二醛固定3h，样品固定后送至中国农业大学电镜室制作超薄切片，利用JEM-1400透射电镜观察人参根尖细胞内部结构，拍照留存。

2 结果与分析

2.1病菌接种后人参根部的症状

接种1d后，人参根表出现微弱锈色斑点，表皮完好。接种4d后，有机械损伤的根部出现锈斑，表皮仍完好。接种7d后，锈斑扩大，易被观察到，表皮有失水现象出现(图1)。

注：A.对照组人参根表；B.接菌1 d后的人参根表症状；C.接菌4 d后人参根表症状；D.接菌7 d后人参根表症状；a.根表有微小锈斑出现；b.根部有机械损伤或结点部位出现锈斑；c.根表细胞失水图1 锈腐菌接种后人参幼根部位的症状

注：A1.对照组人参根尖横切面(10×10倍放大)；B1.接菌7 d后人参根尖横切面(10×10倍放大)；A2.对照组人参根尖横切面(10×40倍放大)；B2.接菌7 d后人参根尖横切面(10×40倍放大);a.表皮细胞壁增厚；b.髓腔内颗粒物沉积图2 人参锈腐菌接种后人参根尖横切面的显微结构

注：A1.对照组人参根尖纵切面(10×10倍放大)；B1.接菌7 d后人参根尖纵切面(10×10倍放大)；A2.对照组人参根尖纵切面(10×40倍放大)；B2.接菌7 d后人参根尖纵切面(10×40倍放大)；a.细胞内充满颗粒物；b.细胞内有菌丝侵入图3 人参锈腐菌接种后人参根尖纵切面的显微结构

2.2人参锈腐菌接种对人参根尖细胞显微结构的影响

在光学显微镜下观察发现，对照组人参幼根表皮细胞形态结构正常，人参锈腐菌接种7d后人参根尖表皮细胞壁出现明显增厚，细胞内出现颗粒物沉积，部分表皮细胞胞壁破裂以及发生细胞解体。且根内髓部同样有颗粒物出现，推测菌丝已侵入木质部，阻碍了根内水分和无机盐的运输，最终导致表皮失水(图2)。

如图3所示，由人参根尖纵切面显微结构可见，对照组人参根尖表皮细胞和韧皮部细胞结构正常，界限分明，表皮细胞排列紧密，且绝大部分细胞的细胞核清晰可见。接种人参锈腐菌7d后人参根尖表皮细胞排列混乱，且表皮细胞出现颗粒物沉积，部分根尖细胞的细胞核难以辨识。在10×40倍视野中，部分细胞内充满菌丝，病变细胞开始溶解。

2.3人参锈腐菌接种对人参根尖细胞超微结构的影响

透射电镜观察发现，对照组人参根尖细胞形状规则，内含物丰富，细胞中心有1个大液泡，细胞核及其他细胞器在细胞边缘，贴近细胞壁分布。接种人参锈腐菌后，人参根尖细胞形态出现异常，细胞内含物减少，细胞器因解体消失而无法辨别(图4)。

注：A.对照组人参根尖细胞；B.处理组人参根尖细胞；CW.细胞壁；N.细胞核；V.液泡；C.d.人参锈腐菌图4 人参锈腐菌接种前后人参根尖超微结构

3 讨论

病原菌与植物间存在互作反应，植物感受到病菌侵染后，会在细胞壁与质膜间沉积形成胞壁沉积物以抵御病菌入侵[8]。病菌侵染早期，植物内部通过信号传递激活效应器，使抗病基因表达上调，做出防卫反应[9]。病原真菌侵染植物的方式较多，如分泌酶类消化细胞壁[10-11]、物理穿透或者二者兼有[12]。立枯丝核菌侵染水稻时产生胞壁降解酶，导致水稻叶鞘细胞膜透性改变，组织结构损伤，以及细胞壁破裂，从而易于病斑形成[13-14]。立枯丝核菌侵染马铃薯时，则先形成附着胞，再形成侵染垫紧贴在寄主表面，通过表皮细胞或细胞间隙进入寄主组织内，侵染顺序为：芽-茎-根-匍匐茎-块茎[15]。疫霉菌侵染大豆幼苗时，先形成附着胞，然后产生入侵结构，从表皮细胞间隙侵入寄主组织，通过细胞间隙向皮层组织扩展。有些病菌在菌丝突破表皮蜡质层后未继续入侵，而是在蜡质层和表皮细胞壁之间扩展[8]。

本研究发现，接种锈腐菌4d后人参根尖开始出现锈斑，表明锈腐菌侵染迅速，人参对锈腐菌的侵染应答可能发生在病菌侵染后1～4d内。锈腐菌接种7d后人参根尖出现明显的锈斑症状，表皮细胞明显增厚并出现颗粒物，表明菌丝主要由表皮细胞侵入。韧皮部细胞基本完好，细胞间隙偶见菌丝，木质部髓腔内出现大量颗粒物，推测菌丝通过细胞间隙侵入木质部阻塞导管，阻碍了人参根部对水分和无机盐的运输，最终导致人参失水腐烂，死亡。本研究未观察到附着胞与侵染垫，推测侵染结构可能在接菌后2～3d内形成，有关人参锈腐菌致病机理以及菌丝侵入途径，有待进一步研究。

[1] 袁忠久，李恩友，王远征，等.人参病害综合防治技术[J].农业与技术，2015，35(2)：124-125.

[2]PunjaZK.FungalpathogensofAmericanginseng(Panaxquinquefolium)in British Columbia[J].Canadian Journal of Plant Pathology，1997(19)：301-306.

[3] Rahman M，Punja Z K.Factors influencing development of root rot on ginseng caused byCylindrocarpondestructans[J].Phytopathology，2005，95(12)：1381-1390.

[4] Kim J H，Kim M S，Jeon Y H，et al.Different structural modifications associated with development of ginseng root rot caused byCylindrocarpondestructans[J].Plant Pathology Journal，2009，25(1)：1-5.

[5] 刘延硕，郜玉钢，王南，等.人参锈腐菌侵染参根后防御酶变化的分析[J].特产研究，2011，33(1)：50-54.

[6] 黄小芳，李勇，易茜茜，等.五种化感物质对人参根系酶活性的影响[J].中草药，2010，41(1)：117-121.

[7] 陈长宝.人参化感作用及其忌连作机制研究[D].长春：吉林农业大学，2006.

[8] 左豫虎，康振生，黄丽丽，等.大豆疫霉菌对大豆下胚轴侵染过程的细胞学研究[J].植物病理学报，2005，35(3)：235-241.

[9] Gao Y，He X，Wu B，et al.Time-course transcriptome analysis reveals resistance genes ofPanaxginsenginduced byCylindrocarpondestructansinfection using RNA-Seq[J].Plos One，2016，11(2)：e0149408.

[10]陈晓波，王冬梅，刘娟，等.植物细胞微丝骨架对真菌侵染的反应[J].河北农业大学学报，2001，24(3)：100-104.

[11]Sathiyaraj G，Srinivasan S，Kim H B，et al.Screening and optimization of pectin lyase and polygalacturonase activity from ginseng pathogenCylindrocarpondestructans[J].Brazilian Journal of Microbiology，2011，42(2)：794-806.

[12]贺闽.植物病原真菌与昆虫病原真菌侵染寄主表皮的分子机制研究[D].重庆：重庆大学，2012.

[13]陈夕军，张红，徐敬友，等.水稻纹枯病菌胞壁降解酶的产生及致病作用[J].江苏农业学报，2006，22(1)：24-28.

[14]张红，陈夕军，童蕴慧，等.纹枯病菌胞壁降解酶对水稻组织和细胞的破坏作用[J].扬州大学学报(农业与生命科学版)，2005，26(4)：83-86.

[15]拓宁，张君，邱慧珍，等.立枯丝核菌对马铃薯侵染过程的显微结构观察与胞壁降解酶活性的测定[J].草业学报，2015，24(12)：74-82.

MicrostructureandUltrastructureChangesofPanaxginsengRootsInfectedbyCylindrocarpondestructansatEarlyStage

GAO Yuan，DING Wanlong，LI Yong*

(Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

Objective：To study the microstructure and ultrastructure changes ofPanaxginsengroots infected byCylindrocarpondestructans.Methods：The paraffin section was used to observe the microstructure of root tips ofP.ginseng.The superfine slice was used to observe the ultrastructure of root tips ofP.ginseng.Results：Microstructure showed that the morphology and structure of epidermal cells ofP.ginsengwere regular in control.However，epidermal cell wall became thicker 7 days post inoculation ofC.destructans，and particles deposition in cells as well as in pith parts was shown.The cell walls were broken，cells began to disintegrate.Ultrastructure showed that morphology of root cells ofP.ginsengwas regular in control.Cells had abundant contents，and organelles were easy to observe.On the contrary，morphology of cells was abnormal and contents in cells were decreased when infected byC.destructans.The organelles were break up，and some of them were disappeared.Conclusion：The hypha invaded the epidermal cells ofP.ginsengmaybe the first step ofC.destructansinfection.Then hypha entered into xylem of ginseng root through the intercellular space，which obstructed the transport of water and inorganic salt，and finally lead to the death of root cells.

Panaxginseng；Cylindrocarpondestructans；infection；microstructure；ultrastructure

中医药行业科研专项(201407005)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-3-017)

] 李勇，研究员，研究方向：药用植物病害生物防治；E-mail：liyong@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.023

2016-11-30)

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