草麻黄根中总黄酮超声提取工艺研究

2017-09-20禹琦

中国当代医药 2017年24期

禹琦

[摘要]目的研究从草麻黄根中提取总黄酮的工艺。方法采用紫外-可见分光光度法测定草麻黄根中总黄酮的含量，考察乙醇浓度、料液比、超声次数和超声时间对总黄酮提取率的影响，并通过正交实验设计优化提取工艺。结果确定紫外检测波长为500 nm，精密度的RSD为1.26%，重现性的RSD为1.07%，在10 h内供试品溶液稳定，加样回收率为98.80%。超声提取的最优工艺参数为料液比是1∶12，乙醇浓度是75%，超声2次，超声时间是30 min。结论工艺操作简便，方法稳定可靠，适合于大规模生产。

[关键词]草麻黄根；总黄酮；正交试验；超声；提取工艺

[中图分类号] R965.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）08（c）-0085-04

[Abstract]Objective To study the extraction process of the total Flavonoids from roots of Ephedra sinica Stapf.Methods The content of total Flavonoids in root of Ephedra sinica Stapf was determined by UV visible spectrophotometry.The influence of ethanol fraction，solid-liquid ratio，extraction duration and extraction times on the extraction rate of total flavonoids were investigated，and the orthogonal design was used to optimize the extraction process.Results The detection wavelength was 500 nm.The RSD of precision and reproducibility tests were 1.26% and 1.07%，the sample was stable within 10 h，and the average recovery rate was 98.80%.The optimum conditions for extracting the total flavonoids were as follow：material-liquid ratio was 1∶12，alcohol concentration was 75%，extraction times was twice and extraction duration was 30 min.Conclusion The extraction process is simple，stable and feasible，and suitable for the industrial production.

[Key words]The roots of Ephedra sinica Stapf；Total flavonoids；Orthogonal experimen；Ultrasonic；Extraction technology

草麻黃根是草麻黄（Ephedra sinica Stapf）的干燥根及根茎，有固表止汗之功效[1]。黄酮类成分具有降压、抗肿瘤等生物活性，是草麻黄根中重要的有效成分之一[2-5]，目前未见其超声提取法报道。本研究通过超声法优选提取总黄酮类化合物的工艺，为草麻黄根的研究和应用提供理论支持。

1仪器与试药

1.1仪器

KQ-100KDB型高功率数控超声器（昆山舒美超声仪器有限公司），UV-2600紫外可见分光光度计（岛津公司）。

1.2试剂与试药

芦丁标准品（中国食品药品检定研究院，编号：100080-201203），草麻黄根（购于长沙佰佳中药饮片有限责任公司），其他试剂试药均为分析纯。

2方法与结果

2.1芦丁标准溶液的制备

取芦丁标准品，精密称量10 mg，放入容量瓶中，加入浓度为70%的乙醇溶液定容至50 ml，摇匀，制成0.2 mg/ml的芦丁标准品溶液。

2.2测定波长的选择

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测量总黄酮含量。精密移取芦丁标准溶液2 ml，移入70%乙醇至6 ml，加入5% NaNO2溶液1 ml，混匀，放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液1 ml，混匀，放置6 min，再加入5% NaOH溶液10 ml，摇匀，加入70%的乙醇定容至25 ml，放置15 min。取此溶液用紫外-可见分光光度计在400～800 nm波长范围内进行扫描[6]，发现在500 nm处有最大吸收值，因此，确定测量波长为500 nm。

2.3标准曲线的建立

取芦丁标准品溶液，精密量取1、2、3、4、5、6 ml，分别移入70%乙醇至6 ml，按“2.2”项下操作，在500 nm波长下测定6份溶液的吸光度。以吸光度（Y）和总黄酮浓度（X）为坐标，绘制标准曲线[7-8]，计算标准方程得：Y=8.2542X-0.0523，r=0.9998，表明芦丁在8～48 μg/ml范围内有良好的线性关系。

2.4供试品溶液制备

精密称取草麻黄根粉1 g，倒入具塞三角瓶中，移入乙醇溶液，开启超声器，超声结束后抽滤，合并滤液，待滤液冷却后，移入相应乙醇，并定容至100 ml，再稀释2倍，即得供试品溶液。其乙醇浓度、料液比、超声时间、超声次数均按照设定的水平。精确移取供试品溶液2 ml，按照“2.2”项下进行操作，在500 nm波长处测量总黄酮吸光度，且使用标准方程算出总黄酮含量[9-12]。endprint

2.5单因素实验

选择料液比、乙醇浓度、超声次数和超声时间4个因素进行单因素考察，将总黄酮含量作为指标，找出上述4因素对总黄酮提取的影响。

2.5.1乙醇浓度的选择精密量取5份草麻黄根粉，各1 g，分别放入具塞三角瓶中，分别移入55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液，料液比（g∶ml）为1∶10，超声30 min，共超声3次，抽滤，合并滤液。滤液冷却后，移入相应的乙醇溶液，定容至100 ml，再稀释2倍，即得待测溶液。分别精确吸取待测溶液2 ml，按照“2.2”项下进行操作，在500 nm处测量总黄酮吸光度，且用标准方程算出总黄酮含量，结果见图1。根据结果可知，随着乙醇浓度的上升，总黄酮提取率先上升后下降，在75%时为最高值，故选择75%的乙醇浓度较为合适。

2.5.2料液比的选择精密称取5份草麻黄根粉，各1 g，分别放入具塞三角瓶中，加入75%乙醇溶液，料液比（g∶ml）分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，超声30 min，共超声3次，抽滤，合并滤液。滤液冷却后，移入75%乙醇溶液，定容至100 ml，再稀释2倍，得待测溶液。分别精确移取上述待测溶液2 ml，按照“2.2”项下进行操作，在500 nm处测量总黄酮吸光度，且用标准方程算出总黄酮含量，结果见图2。根据结果可知，随着料液比的提高，总黄酮的提取率也随之上升，当料液比达到1∶10后，总黄酮提取率增长变缓。考虑到成本因素，选择料液比为1∶10比较合适。

2.5.3超声时间的选择精密称量5份草麻黄根粉，各1 g，分别放入具塞三角瓶中，加入75%乙醇溶液，料液比（g∶ml）为1∶10，超声时间分别为10、20、30、40、50 min，共超声3次，抽滤，合并滤液。滤液冷却后，移入75%乙醇溶液，定容至100 ml，再稀释2倍，即得待测溶液。分别精确吸取上述待测溶液2 ml，按照“2.2”项下进行操作，在500 nm处测量总黄酮吸光度，且用标准方程算出总黄酮含量，结果见图3。根据结果可知，随着超声时间的变长，总黄酮提取率也随之增加，当超声时间达到30 min后，总黄酮提取率增长变缓。考虑到时间成本，选择超声时间为30 min比较合适。

2.5.4超声次数的选择精密量取5份草麻黄根粉，各1 g，分别放入具塞三角瓶中，加入75%乙醇溶液，超声时间为30 min，料液比（g∶ml）为1∶10，超声次数分别选择：1、2、3、4、5次，超声结束后抽滤，合并滤液。滤液冷却后，吸入75%乙醇溶液，定容至100 ml，再稀释2倍，即得待测溶液。分别精确吸取上述待测溶液2 ml，按照“2.2”项下进行操作，在500 nm处测量总黄酮吸光度，且用标准方程算出总黄酮含量，结果见图4。根据结果可知，随着超声次数的增加，总黄酮提取率也随之增加，当达到3次后，总黄酮提取率增长变缓。考虑到成本因素，超声次数选择3次比较合适。

2.6正交试验设计

根据“2.5”项下单因素试验结果，选取料液比、乙醇浓度、超聲次数和超声时间4个因素中最优水平及周边水平，设计正交试验，因素水平考察表见表1。

采用L9（34）正交设计，将总黄酮含量作为考察指标，优选最佳工艺。试验结果和方差分析分别见表2、表3。

由表2可知，4因素的影响为A（乙醇浓度）>B（料液比）>C（提取时间）>D（提取次数）。由表3可知，只有乙醇浓度（A）对提取有显著性影响，其余三因素无显著性影响。最后确定超声法提取总黄酮的最佳工艺为A2B3C2D1，即乙醇浓度为75%，料液比1∶12，超声时间30 min，超声2次。

2.7方法学考察

2.7.1精密度试验精密吸取标准品溶液2 ml，按照“2.2”项下进行操作，在500 nm处测量总黄酮吸光度。测量6次，并用标准方程算出总黄酮含量，计算得RSD值为1.26%，提示其精密度良好。

2.7.2稳定性试验精密称量草麻黄根粉1 g，按照正交试验筛选出的各因素最佳水平，按“2.4”项下进行提取，得供试品溶液。精密移取上述供试品溶液2 ml，分别在0、2、4、6、8、10 h时按“2.2”项下方法测定吸光度，且用标准方程算出总黄酮含量，计算得RSD值为1.33%，提示供试品溶液中的总黄酮含量在10 h内是稳定的。

2.7.3重现性试验精密称量草麻黄根粉1 g，共6份，分别以正交试验筛选出的各因素最佳水平按照“2.4”项下制备，并测定吸光度，且用标准方程算出总黄酮含量，计算得RSD值为1.07%，提示其重现性良好。

2.7.4回收率试验取已知含量的草麻黄根，精密称量6份，每份约0.5 g，放入芦丁对照品溶液，选取正交试验筛选出的各因素最佳水平，按照“2.4”项下制备供试品溶液并测量吸光度，且计算出总黄酮含量。算得平均回收率为98.80%，RSD值为0.90%，提示回收率良好（表4）。结果显示，本方法具有较好的回收率。

2.8验证试验

精密称取草麻黄根粉1 g，按正交试验的最优工艺条件制备3批样品进行试验，得总黄酮含量分别为6.02%、6.11%、5.95%，结果提示此工艺提取率高、稳定性好。

3讨论

超声波是频率20 Hz以上、人们听觉阈外的一种弹性机械振动波，能产生并传递强大的能量，具有机械效应、空化效应、及热效应，是近年来兴起的一项新技术。此方法无须加热，节约溶剂用量，提取时间短，提取温度温和，尤其适用于热不稳定、易水解和易氧化的物质。并且，据有关文献报道，超声波法提取总黄酮的效果要优于传统回流法[8-10]，故笔者选用超声波法进行提取。

本实验先通过单因素试验对料液比、乙醇浓度、超声次数和超声时间4个因素进行考察，筛选出较好的水平；再通过L9（34）正交试验，对这4个因素进行进一步的考察，得出最佳工艺为乙醇浓度75%，料液比1∶12，超声时间30 min，超声2次，并通过试验验证此工艺条件稳定可行，提取的总黄酮含量稳定。本试验有利于草麻黄根的综合利用与开发，可为草麻黄根的工业应用提供工艺参数，也为进一步研究该植物奠定了基础。endprint

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