五味子提取物对贮藏期梨黑斑病的防治研究

高小宽1，刘亚轩2，梁魁景1

五味子提取物对贮藏期梨黑斑病的防治研究

高小宽1，刘亚轩2，梁魁景1

（1衡水学院生命科学系河北衡水053000；2深州市农业局）

以苹果梨为试验材料，研究五味子提取物对梨黑斑病室内毒力测定和梨果实体内损伤接种的影响，从而筛选出最佳抑制浓度。结果表明：在内毒力测定中用4 000 mg/L、2 000 mg/L、1 000 mg/L、500 mg/L和250 mg/L五味子提取物处理均可降低损伤接种果实的发病率和腐烂率，其中4 000 mg/L抑制率高达52.78%，毒力最强EC50为3 196.44 mg/L；在体内损伤接种试验中也使用上述浓度，其中1 000 mg/L的抑制率最低为43.55%，2 000 mg/L抑制率最高为63.31%，毒力最强EC50为480.722 mg/L。

五味子提取物；梨；贮藏期；黑斑病

崔建潮等[3]选用14种杀菌剂对梨黑斑病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用进行了测定，结果表明，苯醚甲环唑对病原菌菌丝生长的毒力最强，有效中浓度EC50为0.421 mg/L。王中华研究了鲍曼菌素对梨黑斑病病原菌孢子萌发具有很强的抑制作用，其效果好于相同浓度的嘧霉胺、苯醚甲环唑、多菌灵和代森锰锌[4]。目前，生产上防治梨黑斑病主要依靠化学药剂，由于长期使用单一杀菌剂会诱导病，致使原物产生抗药性而使得杀菌效果降低[5]。五味子作为一种重要的中药，含有很多有效成分，包括五味子素、五味子醇、去氧五味子素等[6]，马永全、于新的试验表明，五味子提取物具有明显的抗菌和抗氧化作用[7]。本试验选用不同浓度的中药五味子提取物的有效成分，分别通过体内和体外试验筛选出提取物对梨黑斑病抑制的最佳浓度，以期为中药五味子提取物防治梨黑斑病提供依据，为新型生物防腐剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料五味子提取物由西安汇森生物科技有限公司提供，成分和性状见表1。其提取物生产工艺为原料植物经粉碎后用70%乙醇提取3遍，液体合并过滤，经浓缩、喷粉、干燥、粉碎过筛，成品包装。供试病原菌为梨贮藏期黑斑病，采自衡水旧城村梨园带病的苹果梨果，贮藏15 d后取病组织分离得到梨黑斑病菌，经魏景超真菌鉴定手册鉴定为梨黑斑病病菌。培养基为PDA培养基。

表1 五味子提取物成分和性状

1.2 病原菌培养、PDA培养基及孢子悬浮液的制备

1.2.1 病原菌的培养参照方中达方法[8]。

1.2.2 PDA培养基的制备参照方中达方法[8]进行。

1.2.3 孢子悬浮液制备取出预先培养好的备用病原菌，在无菌条件下，往培养好的菌种培养基上加入含有0.01%Tween 80的无菌水10 mL，用已消毒的毛笔将互隔交链孢孢子从培养皿上轻轻刮下，制成浓度为1×106CFU/mL的孢子悬浮液，悬浮液孢子计数采用在10×10倍显微镜下每视野30～35个分生孢子。

1.3 生物测定方法

1.3.1 对菌丝生长的抑制活性测定（采用菌丝生长速率法）在无菌条件下，分别称取0.4、0.2、0.1、0.05和

0.025 g五味子提取物粉末，分别用1 mL的70%乙醇溶解后加入100 mL的PDA培养基中，摇匀后趁热倒入直径90 mm的培养皿内。预先培养梨黑斑病原菌，用灭过菌的直径为6 mm的打孔器在菌落边缘钻取菌饼[9，10]，接种于含有杀菌剂的PDA培养基的中央，菌丝面向下，每皿接种1个菌饼，每个处理3次，25℃光照培养箱培养，每天用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径，共培养观察6 d的结果。观测每天菌落的生长量曲线和计算菌丝生长抑菌率。对照处理指正常PDA培养基未加入抑菌物质，70%乙醇处理指取70%乙醇1 mL加入100 mL的PDA培养基中，提取物是由70%乙醇定容。

1.3.2 对分生孢子萌发的抑制活性测定在无菌条件下。五味子提取物浓度同1.3.1。用接种环取孢子悬浮液均匀涂在加五味子提取物的PDA培养基载玻片上，保湿，放置在25℃光照培养箱条件下培养，6 h后，对照孢子萌发率达到80%，用1 g/L的HgCl2固定，检查孢子萌发率，每个处理观察10个视野约300个孢子，3次重复。孢子萌发以芽管长度超过孢子直径长度（指直径小的一边）的1/2为标准。70%乙醇处理指取70%乙醇1 mL加入100 mL的PDA培养基中，提取物是由70%乙醇溶解。

1.4 处理已经记录的试验数据采用MicrosoftExcel 2010软件处理，以药剂质量浓度的对数为横坐标、抑制率几率值为纵坐标作图，得到毒力回归方程及有效抑制中浓度(EC50)值。

2 结果与分析

2.1 五味子提取物对梨黑斑病菌丝的抑制作用在供试条件下，从表2可以看出：五味子的提取物浓度为4 000 mg/L抑制率为52.78%，浓度在2 000、1 000、500、250 mg/L的抑制率均在50%以下。

因此五味子提取物在4 000 mg/L的较高浓度下对梨黑斑病有比较好的抑制效果，在低浓度下抑制效果并不显著。

表2 五味子提取物对梨黑斑病菌丝生长的影响

2.2 五味子提取物对病原菌丝的的毒力测定Excel软件计算了五味子提取物的毒力回归曲线及EC50。供试五味子提取物不同浓度对梨黑斑病菌菌丝生长有均不同程度的抑制效果，五味子对病原菌的毒力较强EC50为3 196.44（表3）。

表3 五味子提取物对梨黑斑病菌菌丝生长的毒力

2.3 五味子提取物对病原孢子萌发的抑制由表4可知，随着五味子提取物浓度增大相对萌发率降低，且提取物对孢子萌发的抑制作用不同浓度之间存在差异。五味子提取物在250和500 mg/L浓度时孢子萌发率都达到60%以上；浓度为1 000和2 000 mg/L时孢子萌发率都可达到50%，五味子提取物在浓度为4 000mg/L时孢子萌发率为44.44%。结果表明，不同浓度五味子提取物对梨黑斑病原孢子萌发均有抑制作用，且高浓度五味子提取物抑制作用较显著。这一抑制结果与菌丝结果相符。

表4 五味子提取物对梨黑斑病原孢子萌发的抑制

2.4 五味子提取物对梨黑斑病病斑生长的影响各浓度五味子提取物处理与对照相比均能不同程度地抑制损伤接种苹果梨果实病斑直径的扩展，且浓度越高抑制效果越明显（表5），且与对照间差异达显著水平。不同浓度五味子提取物对体内损伤接种果实的发病率均有一定的抑制活性，在250 mg/L时病斑直径最大，抑菌效果最差，升高浓度后相对病斑直径减小。但在500 mg/L和1 000 mg/L浓度之间出现了非正比现象，可能是五味子中等浓度在室内损伤接种试验中出现了不可控因素导致与离体抑菌结果不一致。五味子提取物浓度为250 mg/L时抑制作用最差，500 mg/L和1 000 mg/L的抑制作用较好，4 000 mg/L的五味子提取物抑菌效果最好。

表5 五味子提取物对梨黑斑病病斑生长的影响

2.5 毒力测定Excel软件计算了五味子提取物对梨果实的毒力回归曲线及EC50。五味子提取物的EC50为979.07 mg/L（表6）。

表6 五味子提取物对梨黑斑病病斑生长的毒力

3 结论与讨论

五味子提取物对梨黑斑病菌的菌落生长、菌丝伸长和在体内损伤接种试验中均具有不同程度的抑制效果。

其中，对菌落生长抑菌效果最好的五味子提取物浓度为4 000 mg/L，此抑制率可达到52.78%，对病原菌的毒力最强EC50为3 196.44 mg/L。在损伤接种试验中，浓度为4 000 mg/L的抑菌效果最好，抑制率达到61.44%，毒力最强，EC50为979.07 mg/L。

以上两种试验结果均反映出当五味子提取物的浓度为4 000 mg/L时对梨黑斑病菌的抑制效果最佳。在低浓度下五味子提取物对梨黑斑病菌并没有显著抑菌效果。

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S436.612.1+4

A

10.19440/j.cnki.1006-9402.2017.05.006

2017-06-02

河北省高等学校科学技术研究项目（项目编号：QN2016329）

高小宽（1981-），女，河北正定人，硕士，讲师，研究方向为遗传学。E-mail：xiaokuangao811018@163.com