重组 IL-4R蛋白对 SD大鼠过敏性哮喘干预作用的研究

杨光勇 郭海涛 刘茜明 刘莉莉 何光志

重组 IL-4R蛋白对 SD大鼠过敏性哮喘干预作用的研究

杨光勇 郭海涛 刘茜明 刘莉莉 何光志

目的 探索重组IL-4R蛋白对过敏性哮喘动物模型的干预作用。方法 选择6周龄SD大鼠60只，采用安全随机分组法分成哮喘模型组、IL-4R组、布地奈德组和对照组，每组15只。哮喘模型组在腹部选取3处于皮下注射10%鸡卵清白蛋白（OVA）混合液1ml（OVA 100mg、氢氧化铝100mg及灭活的百日咳杆菌5×109个）进行致敏，1周后用上述同样药物再进行致敏，第2次致敏1周后将大鼠分别放入不完全封闭的箱中，用5%OVA与0.9%氯化钠混合溶液，连续10d超声雾化激发30min。IL-4R组和布地奈德组同法造模，但每次雾化激发前30min，IL-4R组腹腔注射重组IL-4R蛋白稀释液（400μg/d）。布地奈德组腹腔注射布地奈德稀释液（400μg/d），对照组用0.9%氯化钠溶液连续10d超声雾化激发30min。取4组大鼠肺组织作HE染色的光镜病理切片，观察肺组织病理变化。建立间接ELISA方法，检测实验中4组大鼠肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ的含量。结果 哮喘模型组大鼠肺组织有大量嗜酸性粒细胞浸润，对照组大鼠肺组织几乎无嗜酸性粒细胞浸润，IL-4R组和布地奈德组大鼠肺组织嗜酸性粒细胞浸润明显少于哮喘模型组。IL-4R组和布地奈德组肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量明显高于哮喘模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 研究结果提示IL-4R蛋白对过敏性哮喘有良好的干预作用。

IL-4R IFN-γ ELISA 过敏性哮喘

过敏性哮喘占所有哮喘患者的70%，其发病机制尚不完全清楚。目前认为过敏性哮喘主要是由多种炎症细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞等细胞因子共同参与，导致慢性过敏性气道炎症性疾病，而IL-4和IFN-γ等细胞因子在过敏性哮喘发生、发展中起着十分重要的作用[1]。IL-4受体（IL-4R）与IL-4特异性结合后可使IL-4无法发挥其生物学效应，通过抑制IL-4和IL-4R抗体（IL-4Rα）对过敏性哮喘起到有效地免疫调节作用[2-3]，并有望成为治疗过敏性哮喘的有效途径。本研究使用重组IL-4R蛋白干预过敏性哮喘SD大鼠动物模型并检测肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ的含量，探索重组IL-4R蛋白对过敏性哮喘动物模型的干预作用，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 6周龄SD大鼠60只，雌雄各30只，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司（批号：500903559023203）；重组IL-4R蛋白（批号：LC08AP1102）购自北京义翘神州生物技术有限公司；大鼠IL-4 ELISA Kit（批号：20130013）购自杭州联科生物技术有限公司；大鼠IFN-γELISA Kit（批号：20130013），杭州联科生物技术有限公司；灭活的百日咳杆菌原液，北京天坛生物制品股份有限公司；雷诺考特（布地奈德鼻喷雾剂，批号：国药准字J20090079，瑞典阿斯利康公司）；抗IL-4阳性标准样本和阴性标准样本、抗IFN-γ阳性标准样本和阴性标准样本各1份均由实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠建模与分组参考文献[4]，采用安全随机分组法分成哮喘模型组、IL-4R组、布地奈德组和对照组，每组15只。哮喘模型组在腹部选取3处于皮下注射10%的鸡卵清白蛋白（OVA）混合液1ml（OVA 100mg、氢氧化铝100mg及灭活的百日咳杆菌5×109个）进行致敏，1周后用上述同样药物再进行致敏，第2次致敏1周后将大鼠分别放入不完全封闭的箱中，用5%OVA与0.9%氯化钠溶液混合，连续10d超声雾化激发30min。IL-4R组和布地奈德组与哮喘模型组造模方法处理一致，但每次雾化激发前30min，给IL-4R组大鼠腹腔注射治疗剂量的重组IL-4R蛋白稀释液（400μg/d）[5]，布地奈德组大鼠腹腔注射治疗剂量的布地奈德稀释液（400μg/d），对照组用0.9%氯化钠溶液连续10d超声雾化激发30min。观察4组大鼠临床症状和体征。

1.2.2 大鼠肺泡灌洗液收集及肺组织病理检查收集 4组大鼠最后一次激发后的肺泡灌洗液，将其于4℃环境下离心（1 500r/min）10min，收集离心后的上清液，于4℃环境下保存备用。在用药结束后，采用股动脉放血法处死大鼠。取右肺中下叶和副叶，以4%甲醛溶液固定制成标本，并作病理切片（HE染色），在显微镜下观察。

1.2.3 大鼠肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ含量检测 （1）测定标准品IL-4和IFN-γ浓度梯度及肺泡灌洗液最佳稀释倍数：按大鼠IL-4 ELISA Kit和大鼠IFN-γELISA Kit试剂盒说明书操作，分别测定最佳稀释倍数，以抗IL-4阴性标准品和阳性标准品浓度/梯度（P/N）范围的OD450比值所对应的最大稀释倍数作为判断标准。（2）间接ELISA法检测OD450值：参考ELISA试剂盒说明书操作，建立检测IL-4和IFN-γ的OD450值。（3）测定IL-4和IFN-γ酶标二抗最佳工作浓度：酶标二抗按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32作倍比稀释，检测已知IL-4阴性标准品和阳性标准品，进而确定酶标二抗的最佳工作浓度。IFN-γ的酶标二抗最佳工作浓度的确定方法同IL-4。（4）IL-4和IFN-γ阴阳临界值的确定：另选择5份同批次正常SD大鼠肺泡灌洗液进行ELISA检测。按照ELISA Kit试剂盒说明书设置IL-4和IFN-γ的阳性标准品和阴性标准品。计算出本批次SD的大鼠OD450的均数（） 和标准差（s），按±3s公式计算阴阳临界值。（5）特异度实验：本次试验建立IFN-γ间接ELISA方法的特异度验证，通过试剂盒中的IgE、IL-4标准阳性样品来鉴定；采用试剂盒中的IgE、IFN-γ标准阳性品鉴定本次实验建立IL-4间接ELISA方法的特异度。（6）IL-4和IFN-γ检测：采用以上各组检测结果最终计算出4组样本肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠肺组织病理检查 见图1。

图1 4组大鼠肺组织HE染色病理切片（a：对照组大鼠肺泡大小正常，未见炎性细胞浸润；b：哮喘模型组出现区域间质水肿，存在数量多范围广的嗜酸性粒细胞、浆细胞和单核细胞等炎性细胞浸润；c：IL-4R组观察到肺泡变得大小不等，肺泡隔增宽，炎性细胞分布以血管周较多，其余区域较少；d：布地奈德组炎性细胞以血管周围分布较多，其余区域较少，HE染色，×200）

由图1可见，哮喘模型组大鼠肺组织有大量嗜酸性粒细胞浸润，对照组大鼠肺组织几乎无嗜酸性粒细胞浸润，IL-4R组和布地奈德组大鼠的肺组织嗜酸性粒细胞浸润明显少于哮喘模型组。

2.2 IL-4、IFN-γ抗体标准品梯度、肺灌洗液最佳稀释倍数及酶标二抗最佳工作浓度的确定（OD450值） 见表1。

表1 IL-4、IFN-γ抗体标准品梯度、肺灌洗液最佳稀释倍数及酶标二抗最佳工作浓度测定结果（OD450值）

由表1可见，肺灌洗液稀释倍数、抗IL-4抗体标准品和抗IFN-γ阳性标准品均作1∶8倍稀释为最佳工作浓度。在阴、阳性对照差异最大时，IL-4的酶标二抗的稀释度即为最佳工作浓度，此时IL-4酶标二抗1∶4的稀释浓度为最佳工作浓度；而IFN-γ酶标二抗最佳工作浓度为1∶8的稀释浓度为最佳工作浓度。

2.3 IL-4和IFN-γ阴阳临界值确定（OD450值） 见表2。

表2 IL-4和IFN-γ阴阳临界值确定（OD450值）

由表2可见，各组OD450值按x±3s公式计算出IL-4临界值为0.236，IFN-γ阴阳临界值为0.166。

2.4 特异度实验结果 采用含有IgE、IL-4的标准阳性样品对IFN-γ进行特异度验证，其结果全为阴性；采用含有IgE、IFN-γ的标准阳性样品对IL-4进行特异度验证，其结果全为阴性。说明本次试验建立的ELISA方法具有较强的特异度。

2.5 4组大鼠肺泡灌洗液中细胞因子IL-4和IFN-γ的ELISA检测（OD450值） 见表3。

表3 4组大鼠肺泡灌洗液中细胞因子IL-4和IFN-γ的ELISA检测（OD450值）

由表3可见，哮喘模型组细胞因子IL-4高于对照组，IFN-γ低于对照组，IL-4R组、布地奈德组IL-4低于哮喘模型组，IFN-γ高于哮喘模型组，差异均有统计学意义（F=37.594、33.89，均P＜0.05）。

3 讨论

IFN-γ是一种Th1细胞分泌的活性糖蛋白，具有免疫调节作用，并能增强抗病毒能力。IFN-γ可以抑制IL-4的合成及IL-4诱导的免疫球蛋白转换和Th2细胞的增殖，从而抑制IgE的产生[6-7]。Th细胞包括Th1和Th2，是过敏性哮喘关键的效应细胞。Th2分泌IL-13和IL-4等细胞因子能促进IgE的合成，引起哮喘的发生、发展，因而抑制IL-13和IL-4的分泌或作用可以治疗哮喘[8]。在过敏性哮喘急性发作期Th2细胞功能亢进，Th1细胞功能低下，使得IgE大量产生从而导致肥大细胞释放嗜酸性粒细胞趋化因子和血小板活化因子等，这些因子能引起支气管平滑肌痉挛和黏膜水肿等使得支气管腔狭窄、气流受限，从而加重哮喘症状[9]。临床检测也表明，患者体内嗜酸性粒细胞增加、IL-4水平升高、IFN-γ水平降低与儿童支气管哮喘的发生与发展有密切关系[10]。

临床研究发现，在使用双抗体夹心酶联免疫吸附实验、布地奈德及多种中药方剂等药物治疗后，外周血中IFN-γ/IL-4的比值升高的患者过敏性哮喘症状明显改善[11-14]。如在过敏性哮喘豚鼠实验中使用地氯雷他定显著的改善了其肺组织的病理变化，明显降低肺组织IL-4R mRNA表达水平从而抑制IL-4与IL-4R发挥正常作用，缓解哮喘症状[15]。国内外的学者们认为抑制IL-4与IL-4R结合使其不能发挥正常作用是缓解和治疗哮喘的一种有效途径[16-17]，因此IL-4与IL-4R的拮抗剂的开发研究成为目前的研究热点之一[18]。可溶性重组IL-4R蛋白具有与IL-4结合的高度特异度和亲和力，是IL-4R一种理想的拮抗剂。

本研究通过利用可溶性重组IL-4R蛋白作为IL-4R拮抗剂对大鼠过敏性哮喘模型进行干预实验，IL-4R组大鼠在症状体征及肺组织病理观察上明显较哮喘模型组轻，且体内IL-4和IFN-γ含量与哮喘模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），研究结果表明重组IL-4R蛋白能降低过敏性哮喘动物模型肺灌洗液中IL-4，提高IFN-γ的含量，IFN-γ/IL-4比值升高。检测结果显示IFN-γ/IL-4比值升高，提示重组IL-4R蛋白能够抑制大鼠过敏性哮喘的形成，明显干预其发展。

[1]杨光勇,郭海涛,何光志.白细胞介素-4及其受体的研究现状[J].浙江中西医结合杂志,2014,24(9):843-845.d oi:10.3969/j.issn.1005-4561.2014.09.048.

[2]Borish L C,Nelson H S,Corren J,et al.Efficacy of soluble IL-4 receptor for the treatmentofad ults with asthma[J].Journalof Allergy&ClinicalImmunology,2001,107(6):963-970.doi:10.1067/ mai.2001.115624.

[3]Chan M A,Gigliotti N M,Meng J,et al.Asthma-related SNP in FCER2 is associated with increased expression of IL-4R on human B cells[J].InternationalJournalofImmunogenetics,2011,38 (6):533-538.doi:10.1111/j.1744-313X.2011.01043.x.

[4]龚萍.大鼠哮喘模型的改良与评价[D].中南大学,2010.

[5]刘美璇,朱柠,陈小东.吸入性肾上腺糖皮质激素对咳嗽变异性哮喘呼吸道高反应性的影响[J].内科理论与实践,2011,6(2):143-144.

[6]Walsh G M.Anti-IL-4/-13 b ased therap y in asthma[J].Expert Op inion on Emerg ing Drug s,2015,20(3):349-352.d oi:10.1517/ 14728214.2015.1050377.

[7]Rog ala B,Bozek A,Gluck J,et al.Prevalence of Ig E-med iated allerg y and evaluation of Th1/Th2 cytokine profiles in p atients with severe b ronchialasthma[J].Ad vances in Dermatolog y&Allerg ology,2015,32(4):274-280.d oi:10.5114/pdia.2015.53323.

[8]Oeser K,Maxeiner J,Symowski C,et al.T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse mod elofallerg ic asthma[J].Allerg y,2015,70(11):1440-1449.doi:10.1111/all.12705.

[9]Al-Dag hri N M,Ab d-Alrahman S,Draz H,et al.Increased IL-4 mRNA expression and poly-aromatic hyd rocarbon concentrations from children with asthma[J].Bmc Pediatrics,2014,14(1): 1-8.doi:10.1186/1471-2431-14-17.

[10]刘金凤.哮喘患儿嗜酸性粒细胞、IL-4及IFN-γ检测的临床意义[J].中国儿童保健杂志,2014,22（1）:96-98.

[11]张靖华.儿童过敏性哮喘特异性免疫治疗过程中IFN-γ/IL-4比值、FOXP3和CD4～+CD25～+T细胞的变化[D].郑州大学,2010.

[12]徐艳华,郭胤仕.特异性免疫治疗对过敏性哮喘患者外周血IFN-γ、IL-4、IL-10水平的影响 [C]//2007上海过敏性疾病诊断和防治国际论坛论文汇编.2007.

[13]徐友文,李婉红,张亚琼,等.布地奈德对支气管哮喘儿童血CKLF-1、IL-4和IFN-γ水平的影响[J].中华全科医学,2015,13(6):992-995.

[14]刘仁慧,王秀娟,许利平,等.培本中药及其拆方调节哮喘大鼠Th1/Th2平衡的实验研究[J].北京中医药大学学报,2014,37(3): 165-170.d oi:10.3969/j.issn.1006-2157.2014.03.005.

[15]张丽,白茹芹.地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺组织IL-4R mRNA表达的影响[J].药学与临床研究,2015(6):552-554.

[16]Ahmed N,Dhanap ala P,Sup hioglu C.Id entification and Characterization of a Novel IL-4 Recep torαChain(IL-4Rα)Antag onistto Inhibit IL-4 Sig nalling.[J].Cellular Physiology&Biochemistry,2015,36(3):831-842.doi:10.1159/000430259.

[17]Corren J,Busse W,Meltzer E O,etal.A randomized,controlled, phase 2 stud y of AMG 317,an IL-4Ralpha antagonist,in patients with asthma.[J].American Journalof Respiratory&Critical Care Med icine,2010,181(8):788-796.doi:10.1164/rccm.200909-1448OC.

[18]Antoniu S A.Pitrakinra,a dualIL-4/IL-13 antag onistforthe p otentialtreatment of asthma and eczema[J].Current Opinion in InvestigationalDrugs,2010,11(11):1286-1294.

Intervention of allergic asthma with recombinant IL-4R in rats

YANG Guangyong,GUO Haitao,LIU Ximing,et al.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China

Objective To investig ate the effectofrecomb inant IL-4R on allerg ic asthma in rats.Methods Sixty SD rats in 6 wk ofag e were rand omly d ivid ed into mod elg roup,IL-4R g roup,b ud esonid e g roup(as p ositive control)and controlg roup with 15 in each.Asthma mod elwas ind uced with sub cutaneous injection of ovalb umin(OVA).Rats in IL-4R g roup，b udesonide group and controlg roup were g iven intrap eritonealinjection of recomb inant IL-4R(400μg/d),b ud esonid e(400μg/d)or normalsaline, resp ectively.The p atholog ical chang es of lung tissues were ob served with HE staining,the contents of IL-4 and IFN-γ in alveolar lavag e fluid were d etected b y ind irect ELISA method. Results Larg e amount of eosinop hilinfiltration in the lung tissue was ob served in asthma mod elg roup,which were sig nificantly attenuated in IL-4R b ud esonid e g roup s.The contents of IL-4 and IFN-γin alveolar lavag efluid of IL-4R and b ud esonid e g roup s were sig nificantly lower than those of asthma mod elg roup(P＜0.05). Conclusion The results sug g estthatrecomb inant IL-4R can effectively intervene allerg ic asthma in rats.

IL-4R IFN-γ ELISA Allerg ic asthma

2015-11-13）

（本文编辑：杨丽）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.17.2015-1352

2011年贵州省社会发展科技攻关项目［黔科合SY字（2011）3020］、贵州省委组织部高层次人才科研条件特助经费（TZJF-2011年28号）

550025贵阳中医学院基础医学院

何光志，E-mail：heguangzhi7711@sina.com