等位基因特异性PCR法对血液和肿瘤组织EGFR基因突变的比较

2017-09-19张丽华

临床与实验病理学杂志 2017年7期

王铭，张丽华

王铭，张丽华

目的采用等位基因特异性PCR法检测肺癌患者循环肿瘤DNA(ctDNA)和肿瘤组织样本中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变，分析两者关系及检测ctDNA EGFR突变的临床应用价值。方法收集22例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的血液样本和肿瘤组织样本，提取相应血浆游离DNA(cfDNA)和肿瘤组织DNA(tDNA)，通过等位基因特异性PCR法分别检测EGFR第18～21号外显子突变，并将两种样本结果进行比较分析。结果22例NSCLC中，8例血液样本存在EGFR突变，突变率36.4%(8/22)；13例肿瘤组织样本有EGFR突变，突变率59.1%(13/22)；16例血液样本和肿瘤组织样本EGFR检测结果完全一致。以tDNA检出结果为标准，ctDNA诊断EGFR基因突变敏感度为61.5%，特异度为100%；与tDNA结果的一致率为72.7%。结论等位基因特异性PCR法检测ctDNA的EGFR基因突变，为无法获取肿瘤组织标本患者提供新的检测机会。

肺肿瘤；非小细胞肺癌；血浆；表皮生长因子受体；突变

近年表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的应用，有效提高肺癌患者的生存率[1-2]，国内外临床指南均推荐在EGFR-TKIs治疗前行EGFR基因突变检测。由于活检侵入性的检查未能反映治疗过程中肿瘤基因状态和对药物敏感性的动态变化，而血液样本因其非侵入性、可实时监测的特点成为目前分析热点[3-5]。由于外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)含量低，对检测血液样本基因突变的手段提出了挑战[6-7]。本实验采用等位基因特异性PCR法分别对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者石蜡包埋肿瘤组织和血液样本进行EGFR突变检测，以肿瘤组织检测结果为标准，评价等位基因特异性PCR法检测ctDNA EGFR突变的效能，并探讨ctDNA EGFR检测的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1临床资料收集2016年4月～2016年7月东南大学附属中大医院心胸外科手术切除标本7例，呼吸科支气管镜活检、经皮肺穿刺活检及支气管刷片标本11例，胸水离心后细胞块标本4例。所有标本均经病理科医师确诊为NSCLC，其中肺腺癌患者21例，肺鳞癌患者1例。患者均已签署知情同意书。

1.2血浆标本22例NSCLC患者于取组织前72 h抽取全血7 mL，置于EDTA抗凝管，并在抽取后2 h内于3 000 r/min离心10 min，2 mL血浆移到无菌离心管，检测前冻存于-80 ℃。

1.3仪器与试剂实验仪器采用罗氏公司Light Cycler 4800 v2.0荧光定量PCR仪；10%中性福尔马林固定肿瘤组织样本、血液样本分别采用罗氏公司核酸提取试剂盒和血浆游离DNA(cfDNA)样本制备试剂盒提取相应DNA；肿瘤组织样本、血液样本分别采用罗氏Cobas EGFR突变检测试剂盒v1.0和v2.0检测EGFR突变。

1.4肿瘤组织DNA(tDNA)的提取按照罗氏公司核酸提取试剂盒说明书提取tDNA，紫外分光光度计测定所提DNA浓度及纯度，检测时将DNA稀释到2 ng/μL。

1.5cfDNA的提取采用罗氏公司cfDNA样本制备试剂盒，具体操作参考试剂盒说明书进行，提取后随即进行检测。

1.6EGFR突变检测采用罗氏公司Light Cycler 4800 v2.0荧光定量PCR仪，按照罗氏Cobas EGFR突变检测试剂盒v1.0和v2.0说明书进行操作，对提取的tDNA和cfDNA分别进行EGFR突变检测。

1.7统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，通过Fisher确切概率法计算不同性别、年龄、吸烟史、病理分期、组织类型的肿瘤组织标本和血浆标本EGFR 突变是否存在差异；应用Kappa一致性检验比较血浆样本和肿瘤组织样本EGFR检测结果的一致性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床特点本组22例患者中，女性12例(54.5%)，男性10例(45.5%)；年龄46～83岁，平均66.3岁；吸烟患者3例(13.6%)，不吸烟患者19例(86.4%)；Ⅰ期患者2例(9.1 %)，Ⅱ期患者2例(9.1 %)，Ⅲ期患者4例(18.2 %)，Ⅳ期患者14例(63.6%)；肺腺癌患者21例(95.5 %)，肺鳞癌患者1例(4.5%)(表1)。

表1 肺癌患者临床资料及EGFR检测

2.2肿瘤组织样本与血浆样本分析在22例患者中，血浆样本EGFR突变阳性率为36.4%(8/22)，组织样本EGFR突变阳性率为59.1%(13/22)(表2)。16例血浆标本和组织标本EGFR检测结果完全一致，一致率为72.7%(Kappa=0.567)；14例血浆检测阴性的结果中，9例与肿瘤组织检测结果一致，阴性一致率为64.3%(9/14)(Kappa=0.314)；8例血浆检测阳性的结果，7例与肿瘤组织检测结果完全一致，阳性一致率为87.5%(7/8)(Kappa=0.750)，另外1例结果不一致的患者，血浆样本检测结果为21外显子L858R和19del突变，而肿瘤组织样本仅检测到21外显子L858R突变。以tDNA检出的结果为标准，ctDNA诊断NSCLC EGFR基因突变的敏感度为61.5%，特异度达100%(表3)。

表2 肺癌患者临床病理特征及EGFR突变情况

表3 肿瘤组织样本和血液样本EGFR突变的关系

3 讨论

有研究显示，EGFR突变状态也可作为患者的预后标志物[8]。因此，明确患者EGFR突变状态对于预测患者预后、指导其临床用药、判断EGFR-TKIs疗效至关重要。目前，肿瘤组织学标本进行EGFR基因突变检测用于指导NSCLC患者EGFR-TKIs治疗已在全球形成共识，成为检验的金标准[9]，但是许多进展期的患者丧失手术机会，无法获得组织标本用于EGFR基因检测；穿刺活检除对患者存在创伤，也会增加肿瘤种植转移的风险。因此，获得肿瘤组织标本进行基因突变检测存在诸多困难，探讨组织标本替代品势在必行。与传统手术和活检标本相比，血液样本可通过微创手段获得，具有取材方便、无创伤、患者依从性好等优点[1,10]。另外，外周血标本中ctDNA是特征性的肿瘤生物学标志物之一，可实时反映肿瘤发生、发展或治疗过程中的信息，便于指导临床及时调整治疗策略[1]。因此，通过血液标本检测ctDNA基因突变成为近年来国内外分析的热点。

cfDNA EGFR基因突变检测的关键问题是cfDNA的富集提取法以及高灵敏度的检测法。目前，临床cfDNA EGFR基因突变的检测多采用二代测序法，其费用昂贵、过程繁琐复杂、耗时长，并且对取材和操作技术要求较高[11-12]。本实验采用操作简单、均一性和重复性较好、灵敏度相对较高的等位基因特异性PCR法。

一项大型针对1 591例肺癌患者(大部分为中国人)、用不同方法检测血浆EGFR突变的Meta分析结果显示，以肿瘤组织EGFR突变结果为标准，血浆EGFR检测敏感性为64.5%，特异性为88.5%[13]，ctDNA检测EGFR突变的特异性较高，而敏感性较低，因此对于血浆EGFR突变阴性结果的解读必需慎重，避免假阴性结果。2015年一份包含27项研究、3 110个肺癌患者(大部分为亚洲人)的Meta分析结果显示，血液标本与肿瘤组织相比，血液ctDNA检测EGFR突变有更高的准确度和特异性，是检测EGFR突变状态的有效生物学标志物[10]。

本组采用罗氏等位基因特异性PCR法检测22例NSCLC患者，8例血浆样本中检测到EGFR突变，13例组织样本中检测到EGFR突变；突变均为外显子19缺失或21外显子L858R突变。其中，10例男性患者中3例突变阳性，突变率为30%，12例女性患者中10例突变阳性，突变率为83.3%，女性的突变率显著高于男性，差异有统计学意义(P=0.027)，男女性患者血浆与组织样本EGFR结果的一致率分别为80%(Kappa=0.412)、66.7%(Kappa=0.333)；非吸烟患者EGFR突变阳性率差异无统计学意义，血浆与组织样本EGFR结果的一致率为68.4%(Kappa=0.424)。另外，不同病理分期的患者组织样本EGFR突变差异有统计学意义(P=0.026)；血浆样本差异均无统计学意义，Ⅳ期患者血浆与组织样本EGFR结果的一致率为78.6%(Kappa=0.571)；腺癌与鳞癌患者EGFR突变阳性率差异无统计学意义，腺癌患者血浆与组织样本EGFR结果的一致率为71.4%(Kappa=0.471)。本实验以tDNA为标准，ctDNA诊断EGFR基因突变的敏感度为61.5%、特异度为100%，与tDNA结果的总体符合率为72.7%(Kappa=0.567)。本组1例患者肿瘤组织样本检测结果为21外显子L858R突变，血浆样本结果为21外显子L858R和19del突变，两种结果的不一致性可能由肿瘤组织或者转移灶的异质性引起，血液标本则克服了这种不一致性。

目前，液体活检还不能取代组织活检的金标准地位，但在难以获取肿瘤组织时，血浆可以作为替代选择方案用于检测EGFR[14]。由于本实验患者数量较少，对于血浆与组织样本EGFR结果的一致性以及患者性别、吸烟史、病理分期、组织学类型EGFR突变差异需扩大样本量进一步分析，以提供更有力的依据。

[1] 李昊, 钟理, 丁浩, 沈志高. 肺癌个体化治疗的现状及展望[J]. 临床与实验病理学杂志, 2014,30(2):196-199.

[2] Zhou C, Wu Y L, Chen G,etal. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study[J]. Lancet Oncol, 2011,12(8):735-742.

[3] 高胜男，张嘉玲，呼群. 非小细胞肺癌患者循环肿瘤DNA的研究进展[J]. 肿瘤学杂志, 2016,22(3):172-175.

[4] 王晓玫. 影响肺活检小标本组织病理学诊断准确性因素分析[J]. 临床与实验病理学杂志, 2008,24(3):262-265.

[5] Remon J, Moran T, Majem M,etal. Acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in EGFR-mutant non-small cell lung cancer: a new era begins[J]. Cancer Treat Rev, 2014,40(1):93-101.

[6] Misale S, Yaeger R, Hobor S,etal. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer[J]. Nature, 2012,486(7404):532-536.

[7] Chan K C, Jiang P, Zheng Y W,etal. Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing[J]. Clin Chem, 2013,59(1):211-224.

[8] Wojas-Krawczyk K, Krawczyk P, Mlak R,etal. The applicability of a predictive index for second and third-line treatment of unselected non-small-cell lung cancer patients[J]. Respiration, 2011,82(4):341-350.

[9] Zhao X, Han R B, Zhao J,etal. Comparison of epidermal growth factor receptor mutation statuses in tissue and plasma in stage I-IV non-small cell lung cancer patients[J]. Respiration, 2013,85(2):119-125.

[10] Qiu M, Wang J, Xu Y,etal. Circulating tumor DNA is effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung cancer: a meta-analysis[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2015,24(1):206-212.

[11] Sundaresan T K, Sequist L V, Heymach J V,etal. Detection of T790M, the acquired resistance EGFR mutation, by tumor biopsy versus noninvasive blood-based analyses[J]. Clin Cancer Res, 2016,22(5):1103-1110.

[12] Xu S, Lou F, Wu Y,etal. Circulating tumor DNA identified by targeted sequencing in advanced-stage non-small cell lung cancer patients[J]. Cancer Lett, 2016,370(2):324-331.

[13] Li Z, Zhang Y, Bao W,etal. Insufficiency of peripheral blood as a substitute tissue for detecting EGFR mutations in lung cancer: a meta-analysis[J]. Target Oncol, 2014,9(4):381-388.

[14] Zhang Y, Bao W, Li Z. Limitations in the use of serum epidermal growth factor receptor mutations as prognostic markers for non-small-cell lung cancer[J]. Med Princ Pract, 2015,24(5):486-490.

ComparisonofEGFRmutationsinbloodandtumortissuesamplesbyallele-specificPCR

WANG Ming, ZHANG Li-hua

(DepartmentofPathology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210000,China)

PurposeTo explore the clinical application value of allele specific PCR in detection of ctDNA EGFR mutations by comparing the epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation in tumor tissue specimens and circulating tumor DNA (ctDNA) of lung cancer patients by allele-specific PCR.Methods22 pairs of plasma samples and tumor tissue samples of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients were collected and the corresponding cfDNA and tDNA were extracted. The cobas EGFR mutation test v2.0 and cobas EGFR mutation test were used to detected EGFR 18-21 exon mutation, respectively.ResultsAmong 22 patients with NSCLC, there were 8 cases of EGFR mutations in plasma samples, so the mutation rate was 36.4% (8/22). The presence of EGFR mutations in tumor samples was 13 cases, and the mutation rate was 59.1% (13/22). EGFR mutation status of 16 patients in plasma samples was consistent with tumor tissues. The result of tDNA gene mutations was regarded as the standard. Sensitivity of gene mutations in ctDNA was 61.5%, and specificity was 100%. The concordance rate between result of tDNA and ctDNA was 72.7%.ConclusionDetection of ctDNA EGFR gene mutations by allele-specific PCR provides a new detection opportunity for patients unable to obtain tumor tissue specimens.

lung neoplasm； non-small cell lung cancer； plasma； epidermal growth factor receptor； mutation

时间：2017-7-18 11:51 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.014.html

东南大学附属中大医院病理科，南京 210000

王铭，女，博士，技师。E-mail: wangyoucao198710@126.com 张丽华，女，博士，副教授，主任医师，通讯作者。E-mail: 15905179393@126.com

R-331

:1001-7399(2017)07-0769-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.014

接受日期：2017-05-24