肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表达与K-RAS基因突变状态的相关性分析

王 珊，董丽儒，任会强，刘爱东，熊艳杰，宋旭东

肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表达与K-RAS基因突变状态的相关性分析

王 珊，董丽儒，任会强，刘爱东，熊艳杰，宋旭东

目的探讨肺腺癌程序性死亡分子-1(programmed death 1, PD-1)、程序性死亡分子配体-1(programmed death ligand 1, PD-L1)蛋白的表达与K-RAS基因突变的相关性。方法采用免疫组化EnVision两步法检测PD-1、PD-L1蛋白的表达，应用实时荧光定量PCR技术检测K-RAS基因的突变类型。结果肺腺癌组织中PD-1、PD-L1的阳性率均高于良性病变肺组织(P<0.01)，PD-1、PD-L1蛋白表达与患者性别、年龄、吸烟史、分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无相关性(P>0.05)。36例肺腺癌样本中发生K-RAS基因突变者8例(22.2%)，K-RAS基因突变与患者性别、年龄、吸烟史、分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无关(P>0.05)。相关分析显示PD-1、PD-L1蛋白表达与K-RAS突变无关(P>0.05)。结论PD-1、PD-L1蛋白在肺腺癌中的表达明显高于良性病变肺组织，但两者表达程度与肺腺癌的临床病理特征及K-RAS基因突变无关。

肺肿瘤；腺癌；PD-1；PD-L1；K-RAS基因突变

肺癌是全球发病率最高的实体肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)所占比例最高，NSCLC又包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌。近年，肺癌的靶向治疗以及免疫治疗已成为临床分析的热点。程序性死亡分子-1(programmed death 1, PD-1)是主要表达在活化T细胞上的抑制性受体之一，与程序性死亡分子配体-1(programmed death ligand 1, PD-L1)结合，可显著抑制T细胞的活化和增殖。最近，文献报道EGFR突变的NSCLC高表达PD-L1蛋白[1]。本文着重探讨肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白的表达及其与K-RAS基因突变的相关性。

1 材料与方法

1.1临床资料收集河北省唐山市人民医院2015年9月～2016年2月及华北理工大学附属医院2012年1月～2016年6月接受肺癌根治术，且组织学证实为肺腺癌患者的石蜡标本36例。所有患者术前均未行放、化疗，临床病理资料完整。患者年龄41～76岁，中位年龄61岁。另随机收集20例良性病变肺组织作为对照。

1.2主要试剂兔抗人单克隆抗体PD-1、PD-L1(Abcam公司)，石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，购自北京天根公司；K-RAS基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自北京鑫诺美迪公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化 免疫组化采用EnVision两步法，石蜡切片经二甲苯透明，梯度乙醇脱蜡至水，高压修复后用3%H2O2封闭10 min，滴加一抗PD-1或PD-L1，4 ℃过夜；取出切片恢复至室温，滴加二抗；37 ℃恒温箱孵育30 min后滴加DAB显色，苏木精复染，分化，返蓝，脱水，透明，封固。

1.3.2实时荧光定量PCR 按试剂盒说明书提取DNA，配制反应体系，将反应体系置于Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR基因扩增仪内进行扩增(表1)。PCR反应程序：预变性95 ℃ 3 min，循环1次，变性94 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 35 s，循环45次。通过Bio-Rad CFX Manager分析K-RAS突变结果。

1.4结果判断

1.4.1PD-1结果判断 PD-1主要表达于活化T细胞的胞质和胞膜，呈棕黄色粗颗粒状。以细胞计数法评估，在低倍镜下观察整张切片，寻找高密度淋巴细胞，随机选择5个高倍视野，每视野计数100个淋巴细胞中PD-1阳性细胞数，并求其平均值作为PD-1阳性细胞数。以36例肺腺癌中PD-1阳性细胞数的均值作为阈值，大于该阈值为PD-1阳性，低于该阈值为PD-1阴性[2]。

1.4.2PD-L1结果判断 PD-L1主要表达于肿瘤细胞的胞质和胞膜，呈棕黄色粗颗粒状。采用二级记分法，按细胞着色程度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按细胞阳性比例评分：阳性细胞数≤2%为0分，2%～10%为1分，10%～50%为2分，>50为3分。最后将两者相乘：得分>3分为阳性；≤3分为阴性[3]。

1.4.3K-RAS结果判断 确定每个突变反应孔Ct值(CtM)和外控Ct值(CtW)，计算每个突变反应孔的△Ct(CtM - CtW)值，若△Ct≤8，且同时满足CtW<30；即可确定样本为突变型。

1.5统计学分析所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，PD-1、PD-L1蛋白表达及K-RAS基因突变状态与肺腺癌临床病理特征分析采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PD-1、PD-L1蛋白表达与肺腺癌临床病理特征的关系36例肺腺癌中PD-1阳性率为50%(18/36)，PD-L1阳性率为44.4%(16/36)，良性病变肺组织中PD-1、PD-L1的阳性率均为0(0/20)。肺腺癌中PD-1、PD-L1的阳性率均高于良性病变肺组织(P<0.05，表2，图1)。肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表达与患者性别、年龄、吸烟与否、分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无关(P>0.05，表3)。

表1 K-RAS扩增引物序列

表2 PD-1、PD-L1蛋白在肺腺癌及良性病变肺组织中的表达

表3 PD-1、PD-L1蛋白表达与肺腺癌临床病理特征的关系(n=36)

ABC图1 A.肺腺癌的肿瘤细胞核质比增大,呈腺管样结构排列;B.肺腺癌中PD-1呈阳性,EnVision两步法;C.肺腺癌中PD-L1呈阳性,EnVision两步法

表4 肺腺癌中K-RAS基因突变检测(n=36)

表5 K-RAS基因突变与肺腺癌临床病理特征的关系(n=36)

2.2K-RAS基因突变与肺腺癌临床病理特征的关系36例肺腺癌中检出K-RAS突变8例(表4，图2)，突变率为22.2%。统计结果显示K-RAS基因突变与患者性别、年龄、吸烟与否、分化程度、有无淋巴结转移均无关(P>0.05，表5)。

2.3PD-1、PD-L1蛋白表达与K-RAS突变的相关性分析相关性分析表明，PD-1蛋白表达与K-RAS突变无关(r=0.134，P>0.05)；PD-L1蛋白表达与K-RAS突变无关(r=-0.075，P>0.05)。

图2 肺腺癌K-RAS基因突变实时荧光定量PCR扩增分析 A.GGT>TGT；B.GGT>AGT；C.GGT>GTT；D.GGT>GAT

3 讨论

人PD-1基因定位于染色体2q37.3，编码免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，多表达于活化的T细胞。目前，PD-1的配体被证实有2个，分别为PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是PD-1的主要配体，普遍表达于抗原提呈细胞、活化的T细胞及B细胞、内皮细胞等。PD-L1基因定位于染色体的9p24，编码含有290个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白。正常人体中，PD-1与PD-L1结合，使T细胞的活化被抑制，具有负性免疫调节作用[4]。由于正常T细胞表达PD-1，PD-L1在肿瘤细胞表面表达，故现阶段文献报道PD-L1较多。目前，关于PD-L1蛋白表达与肺癌临床病理特征的关系报道不一致。Song等[5]发现PD-L1的表达与肺癌临床病理特征均无相关性。宋燕秋等[6]实验结果表明78例肺腺癌组织中PD-L1在女性、非吸烟及Ⅱ～Ⅲ期中的表达水平高于男性、吸烟者及Ⅰ期患者。本实验结果显示PD-1、PD-L1阳性率与患者性别、年龄、吸烟与否、分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无差异。文献报道结论不一致，可能与免疫组化检测PD-L1的阳性判读标准不统一有关。Reck等[7]比较抗PD-1的靶向药Pembrolizumab与铂类为基础的化疗药治疗PD-L1阳性NSCLC患者，发现Pembrolizumab组无进展生存期和总生存期明显延长。因此，免疫治疗有望给更多NSCLC患者带来希望。

K-RAS蛋白相对分子质量为2.1×104，故也被称为p21蛋白。K-RAS蛋白位于细胞膜内面，具有内在GTP酶活性，K-RAS蛋白通过与GTP结合后被活化，参与调节细胞的生长、增殖。K-RAS基因突变后其编码的p21蛋白活性降低，失去内在GTP酶活性，从而使信号传导一直处于激活状态，持续刺激细胞生长、发育、增殖，引起细胞恶变[8]。K-RAS基因突变率在人种之间存在差异，西方NSCLC人群中突变率较高，在肺腺癌中甚至达30%。亚洲NSCLC人群的突变率为4%～24%[9]。K-RAS基因突变主要发生于第2外显子的12及13号密码子上，其中12号密码子的突变率(92%)明显高于13号密码子(8%)[10]。本实验结果显示，肺腺癌中K-RAS基因突变率为22.2%，均发生在12号密码子，与上述文献结果相符。目前，对K-RAS基因突变与肺癌临床病理特征关系的相关分析尚未统一。Brcic等[11]分析273例肺腺癌患者的K-RAS基因状态，发现吸烟者K-RAS突变率高于非吸烟者，K-RAS突变与患者性别、年龄、临床分期均无关。张卉等[12]认为K-RAS基因突变与患者性别、年龄、分期、吸烟史无关。本实验结果与国内学者报道相符，可能由于亚洲人群肺癌K-RAS突变率较低、样本量不足导致抽样有误差。

目前，针对K-RAS基因突变患者的治疗仍未找到理想靶向药物。随着免疫治疗的不断发展，K-RAS基因突变患者能否从免疫治疗中获益也成为研究的新方向。D’Incecco等[13]在122例NSCLC样本中评估PD-1蛋白表达及K-RAS基因突变状态，发现PD-1阳性与K-RAS突变状态显著相关，K-RAS基因突变的患者有更高的PD-1蛋白表达。有学者通过分析K-RAS基因突变的肺腺癌细胞系，发现阻断K-RAS的下游通路可以减少肿瘤细胞表面PD-L1的表达。他们认为K-RAS所在的MAPK通路对细胞表面PD-L1蛋白表达起主导作用[14]。Ji等[15]结果显示PD-1蛋白表达与K-RAS基因突变呈负相关。本组通过相关性分析，并未发现PD-1、PD-L1蛋白的表达与K-RAS突变存在相关性。

综上所述，现阶段K-RAS基因突变与PD-1、PD-L1表达的相关性报道各异，可能是由于K-RAS基因突变在人种之间的差异；另外，上述报道均采用免疫组化法检测PD-1、PD-L1蛋白的表达，但目前尚无统一的阳性标准，也造成统计结果之间的差异。因此，对于K-RAS基因突变与PD-1、PD-L1蛋白表达之间的相关性，仍需更深入的分析。

[1] Lin K L, Cheng J N, Yang T,etal. EGFR-TKI down-regulates PD-L1 in EGFR mutant NSCLC through inhibiting NF-κB[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,463(1-2):95-101.

[2] 马 薇，罗殿中，陈 源，等. PD-L1和PD-1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义[J]. 实用医学杂志, 2011,27(9):1551-1554.

[3] Mu C Y, Huang J A, Chen Y,etal. High expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis and tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic cells maturation[J]. Med Oncol, 2011,28(3):682-688.

[4] 刘亚岚，蒋冬先，侯英勇，等. 食管鳞状细胞癌中PD-L1的表达及其预后意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2017,33(4):355-359.

[5] Song Z B, Yu X M, Cheng G P,etal. Programmed death-ligand 1 expression associated with molecular characteristics in surgically resected lung adenocarcinoma[J]. J Transl Med, 2016,14(1):188.

[6] 宋燕秋，吕坤聚，王 丽，等. 肺腺癌中PD-L1、B7H3的表达与EGFR基因突变的关系[J]. 临床肺科杂志, 2016,21(5):866-873.

[7] Reck M, Rodriguez-Abreu D, Robinson A G,etal. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med, 2016,375(19):1823-1833.

[8] Bos J L. Ras oncogenes in human cancer: a review[J]. Cancer Res, 1989,49(17):1352.

[9] 罗 炜，王 慧，徐韫健. 非小细胞肺癌患者KRAS基因突变情况分析[J]. 广东医学, 2014,13(35): 2025-2028.

[10] Yu H A, Sima C S, Shen R,etal. Prognostic impact of KRAS mutation subtypes in 677 patients with metastatic lung adenocarcinomas[J]. J Thorac Oncol, 2015,10(3):431-437.

[11] Brcic L, Jakopovic M, Misic M,etal. Analysis of the frequency of EGFR, KRAS and ALK mutations in patients with lung adenocarcinoma in Croatia[J]. Diagn Pathol, 2016,11(1):90.

[12] 张 卉，杨新杰，秦 娜，等. 肺腺癌EGFR与KRAS基因突变状态分析[J]. 中国肺癌杂志, 2015,18(11):686-690.

[13] D’Incecco A, Andreozzi M, Ludovini V. PD-1 and PD-L1 expression in molecularly selected non-small-cell lung cancer patients[J]. Br J Cancer, 2015,112(1):95-102.

[14] Sumimoto H, Takano A, Teramoto K,etal. RAS-mitogen-activated protein kinase signal is required for enhanced PD-L1 expression in human lung cancers[J]. PLoS One, 2016,11(11): e0166626.

[15] Ji M, Liu Y, Li Q,etal. PD-1/PD-L1 expression in non-small-cell lung cancer and its correlation with EGFR/KRAS mutations[J]. Cancer Biol Ther, 2016,17(4):407-413.

RelevantresearchofPD-1,PD-L1proteinexpressionandK-RASgenemutationsinlungadenocarcinoma

WANG Shan, DONG Li-ru, REN Hui-qiang, LIU Ai-dong, XIONG Yan-jie, SONG Xu-dong

(DepartmentofPathology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan063000,China)

PurposeTo investigate the association of the PD-1 and PD-L1 protein expression with K-RAS gene mutations in lung adenocarcinoma.MethodsThe protein expression of PD-1 and PD-L1 was detected by immunohistochemical EnVision two-step staining, the K-RAS mutation was examined by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsThe positive rate of PD-1 and PD-L1 was higher in lung adenocarcinoma than benign lung disease (P<0.01). There was no relationship between PD-1 and PD-L1 protein expression with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The K-RAS gene mutations were detectable in 8 patients (22.2%) among 36 lung adenocarcinoma, there was no association between K-RAS gene mutation with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The correction analysis showed that there was no relationship between PD-1 and PD-L1 protein expression with K-RAS mutation (P>0.05).ConclusionThe positive rate of PD-1 and PD-L1 is higher in lung adenocarcinoma than benign lung disease, but there is no relationship among PD-1 and PD-L1 protein expression with its clinal pathological characteristics and K-RAS mutation in lung adenocarcinoma.

lung neoplasm；adenocarcinoma；PD-1；PD-L1；K-RAS gene mutations

时间：2017-7-18 11:51 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.011.html

2016年河北省政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究(361036)

河北省唐山市华北理工大学附属医院病理科 063000

王 珊，女，硕士研究生。E-mail: 496874845@qq.com 宋旭东，男，教授，硕士生导师，主任医师，通讯作者。E-mail: songxd2002@sina.com

R 734.2

:A

:1001-7399(2017)07-0754-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.011

接受日期：2017-05-22