儿童神经母细胞源性肿瘤的形态及分子遗传学改变及临床意义

许恪淳，管雯斌，许艳春，王晓颖，王立峰，祝明洁

儿童神经母细胞源性肿瘤的形态及分子遗传学改变及临床意义

许恪淳，管雯斌，许艳春，王晓颖，王立峰，祝明洁

目的探讨儿童神经母细胞源性肿瘤的组织学特征、免疫表型及MYCN扩增特点，判断其生物学行为及预后。方法分析100例神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)及节神经母细胞瘤(ganglioneuroblastoma, GNB)的组织学形态、免疫表型及60例MYCN扩增。结果100例NB及GNB患儿，平均年龄2.7岁，男性多于女性；NB分为未分化型、差分化型、分化型；GNB分为混合型(iGNB)和结节型(nGNB)。免疫表型：神经母细胞不同程度的表达NSE、NF、PGP9.5、Syn、CgA；Schwannian细胞表达S-100、GFAP。11.67%的患者伴MYCN扩增，iGNB无MYCN扩增。结论神经母细胞源性肿瘤的诊断主要根据组织学形态，特殊检查(免疫组化、电镜和细胞遗传学)可以帮助鉴别未分化的母细胞成分。神经母细胞源性肿瘤的预后根据患者年龄、肿瘤的分型分期、分子遗传学改变等指标综合评估。

神经母细胞瘤；节神经母细胞瘤；诊断标准；分子生物学；预后

神经母细胞源性肿瘤起源于原始神经嵴细胞，好发于婴幼儿及儿童，根据肿瘤的不同分化及成熟程度分为神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)、节神经母细胞瘤(ganglioneuroblastoma, GNB)及节细胞神经瘤(ganglioneuroma, GN)。本文现收集100例NB及GNB的患者进行临床病理分析，并结合文献复习其诊断及鉴别诊断。

1 材料与方法

1.1临床资料收集2013～2016年上海交通大学附属新华医院病理科诊断为NB和GNB的100例。100例患儿中，女性37例，男性63例，男性发病率高于女性患者。患儿年龄21 h～13岁，平均发病年龄2.7岁。未分化型及差分化型NB平均2岁，分化型NB平均2.9岁。混合型节神经母细胞瘤(iGNB)患者平均年龄4岁，结节型节神经母细胞瘤(nGNB)患者平均年龄3.7岁，NB比GNB平均发病年龄稍小。该肿瘤好发于肾上腺/后腹膜(69%)，其次是纵隔(18%)、椎管(6%)、骶尾部(3%)，还包括其他一些少见部位：腹腔(2%)、颈部(1%)、肝脏(1%)。

1.2方法所有切除标本均经10%中性福尔马林固定、脱水、透明、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，HE染色。由两位病理科医师采用双盲法在显微镜下进行观察和分型。

1.3免疫组化所有标本均经免疫组化采用EnVision法染色，观察NSE、NF、PGP9.5、Syn、CgA、S-100、GFAP等标志物在NB和GNB中的表达情况。相关试剂、二抗及DAB显色剂均购自上海长岛公司。

1.4FISH检测利用位点特异性MYCN/CEP2双色探针检测MYCN改变，其中橙色荧光标记2号染色体的α卫星DNA(CEP2)，以计数2号染色体的数目；MYCN以绿色荧光标记。探针与靶基因杂交后，在橙绿滤光片下观察，正常间期细胞核中，显示2个橙色、2个绿色荧光信号。若存在2号染色体或MYCN数目异常时，细胞核中橙色或绿色信号则增多或减少。若MYCN拷贝数目增加时，相对于2号染色体数目，每单倍体基因组中MYCN拷贝数的增加介于4～100称为扩增，MYCN拷贝数增加介于1～4为获得。所用探针均购自美国Vysis/Abbott公司。

2 结果

2.1病理检查眼观：NB为分叶状肿块，直径1～10 cm，平均6 cm，质嫩，切面呈灰白色，局部灰红色，化疗后标本局灶伴钙化及坏死。iGNB为棕褐色-白色结节状肿块，直径1.5～13 cm，平均6 cm。nGNB为一个或多个结节状肿块，直径3～17 cm，平均7.8 cm，切面常见部分结节为灰红色/出血性。镜检：国际神经母细胞瘤病理学会推荐使用由Shimada等[1]提出的分类方案，本组诊断69例NB，根据肿瘤组织中Schwannian细胞基质稀少/缺乏及神经母细胞的分化程度，包括3个亚型：未分化型4例(图1A)、差分化型43例(图1B)、分化型22例(图1C)。诊断31例GNB，根据肿瘤组织中NB成分与周围基质(包括GN或Schwannian基质)的构成方式，诊断iGNB 20例，nGNB 11例，iGNB组织学表现为富于Schwannian基质，NB成分呈多灶状/小巢分布在基质中(图1D)；nGNB组织学形态为富于Schwannian基质/Schwannian基质优势和基质少，神经母细胞成分与GN成分之间有明显的分界。nGNB包括4个组织学变异型：经典型(7例)、多结节型(2例)、大结节型(1例)和无结节型(1例)。

2.2免疫表型神经母细胞均可不同程度的表达一种或几种神经源性标志物，包括NF(图2A)、PGP9.5、Syn(图2B)、CgA、NSE，未分化型4例，其中1例Syn、CgA均呈阴性。Schwannian基质表达S-100(图2C)、GFAP(图2D)。

2.3MYCN基因检测60例NB和GNB：未分化型NB(1/4)、差分化型NB(4/31)、分化型NB(1/8)、nGNB(1/5)均有MYCN扩增，且平均拷贝数/细胞>4个信号位点；iGNB(0/12)均无MYCN扩增。

3 讨论

神经母细胞肿瘤临床罕见，是5岁以下儿童最常见的实体肿瘤之一，很少发生于成人。本组神经母细胞肿瘤好发年龄2～4岁，男性发病率高于女性。NB发生于儿童期肾上腺和交感神经，是来自于神经嵴的神经外胚层移行细胞的胚胎型肿瘤。常见部位是肾上腺/后腹膜、纵隔，少见发生于椎管内、骶尾部、腹腔、头颈部、肝脏、甲状腺、肺、肾脏[2]。

3.1诊断NB的组织学特点：Schwannian基质少/缺乏，主要由神经母细胞组成，瘤细胞生成的轴索构成嗜酸性原纤维网，称为神经纤维网/神经毡。瘤细胞围绕中心无空腔结构的神经元纤维形成典型，即Homer-Wright菊形团。NB分为3个亚型：(1)未分化型，由幼稚的小圆细胞组成，均为母细胞，弥漫性生长，无明显的节细胞分化，无神经毡和菊形团结构。诊断需借助特殊检查(免疫组化、电镜或细胞遗传学)，免疫组化选择性的表达一种或几种神经源性标志物，一般均表达NF、PGP9.5，部分病例不表达Syn及CgA。(2)差分化型，3亚型中最为常见，肿瘤细胞小，核质比高，可形成Homer-Wright菊形团，可见神经毡背景，节细胞分化<5%，表现为细胞核和胞质的分化，分化神经母细胞核的特征为核大、染色质空泡状、单个明显的核仁偏心性位于核内；胞质的特质为嗜酸性/双嗜性，直径是核的2倍以上。(3)分化型，伴大量神经毡背景，节细胞分化>5%，局部区域可以向iGNB过渡，但iGNB样区域的量必须少于50%[3]。

①A①B①C①D②A②B②C②D

图1神经母细胞肿瘤的组织学形态：A.未分化的神经母细胞；B.差分化的母细胞及神经毡背景；C.分化的母细胞及神经毡背景；D.神经母细胞巢混杂于基质中图2A.NF表达于神经母细胞膜，EnVision法；B.Syn表达于神经母细胞膜和细胞质，EnVision法；C.S-100表达于Schwannian细胞膜和细胞质，EnVision法；D.GFAP表达于Schwannian细胞膜和细胞质，EnVision法

GNB的诊断及分型要点依据NB成分与周围基质的构成方式。(1)iGNB为Schwannian基质丰富的肿瘤，NB成分呈多灶状、小巢状分布在Schwannian细胞基质中，灶性分布的NB成分由不同分化阶段的神经母细胞及神经毡背景组成。周围的Schwannian基质中可见成熟和即将成熟的节细胞。NB成分未形成独立的结节状结构。iGNB可以看做是NB向成熟的GN分化的中间过程，其组织学形态与完全分化、成熟的GN有重叠或过度。部分分化型NB与iGNB镜下的图像可有重叠，因此我们要求Schwannian基质成分占肿瘤组织50%以上才可以诊断为iGNB。(2)nGNB的诊断大体表现非常重要，通常可见神经母细胞性结节，肉眼表现为出血性的肿瘤结节。常与iGNB或GN同时存在。镜下神经母细胞性结节与周围间质出现明确的分界，神经母细胞性结节周围间质呈GN图像或iGNB图像。根据结节的分布特征，可以分为4个组织学变异型[4]：经典型、多结节型、大结节型和无结节型。经典型：大体可见神经母细胞结节，镜下神经母细胞结节与周围间质有明显分界；多结节型：大体可见2个以上神经母细胞结节，镜下与经典型一致；大结节型：因NB结节巨大，占据肿瘤的主要部分，镜下仅可见肿瘤边缘有少量iGNB或GN肿瘤组织成分；无结节型：原发的肿瘤呈iGNB或GN图像，但淋巴结、骨或其他部位的转移灶中呈NB图像。nGNB可作为1个多克隆的复合型肿瘤，它包含的多种成分生物学行为不同。出血性NB结节，代表侵袭性强的部分，而iGNB或GN成分，代表侵袭性差的克隆。在这种多克隆的肿瘤中，不同成分的基因表达可以是不相同的[5]。国际神经母细胞瘤的组织学分型(Shimada标准)，根据患者年龄、肿瘤组织学类型及核分裂-核碎裂指数(MKI)，分为预后好/预后差型。预后好型按年龄分2组： <1.5岁的差分化型或分化型肿瘤，伴低(<2%)或中(2%～4% )MKI；1.5～5.0 岁的分化型和低MKI。预后差型按年龄分4组：<1.5 岁的未分化型肿瘤；1.5～5.0 岁的未分化或差分化型肿瘤 伴中/高MKI；>5岁的任何亚型；任何年龄的高MKI肿瘤。低MKI:<2%或<100/5 000细胞；中MKI：2%～4% 或100～200/5 000细胞；高MKI：>4%或>200/5 000细胞。nGNB根据肿瘤中NB成分，按Shimada标准分型[4]。

3.2鉴别诊断鉴别诊断 GN成熟中型：此型主要与iGNB鉴别，两者均可见Schwannian基质，并可见各种分化程度的神经母细胞和节细胞。前者中肿瘤基质均为丛状基质，由Schwannian细胞和神经膜细胞的突起构成，分化的神经母细胞和节细胞散在分布于丛状基质中，而iGNB的神经母细胞巢的背景为神经毡样的神经纤维网，散在各种分化程度的神经母细胞，包括神经母细胞、分化的神经母细胞和(或)节细胞，周围围绕富于Schwannian基质的GN成分。与nGNB的区别在于后者存在NB结节或NB原发灶。其他类型的小细胞恶性肿瘤：主要包括原始神经外胚层肿瘤/尤因肉瘤、淋巴瘤、横纹肌肉瘤等，主要与未分化型NB鉴别。鉴别诊断需借助免疫组化染色或基因检测等特殊检查。

3.3分子遗传学改变了解神经母细胞肿瘤的分子病理及基因改变，有助于评估预后，并指导临床个体化治疗，减少化疗带来的毒副反应，并对传统化疗药物不敏感的病例进行更强和新型的治疗。(1)MYCN：扩增常出现于未分化/差分化的神经母细胞。如果肿瘤出现MYCN扩增，并伴高增殖指数及较多凋亡(高MKI)，提示肿瘤可能有较差的预后[6]。本组中并未发现iGNB伴MYCN扩增，与以上几种类型相比，iGNB的MYCN扩增罕见，证明iGNB预后好。当肿瘤的组织学分型与基因分型不一致，即肿瘤组织学分型为预后好型，但伴MYCN扩增，研究指出伴MYCN扩增患者组的预后比无MYCN扩增组预后差[7]。因此，检测肿瘤的MYCN对于判断肿瘤的预后非常重要。(2)染色体异常：在局限性和播散的神经母细胞的肿瘤细胞中发现多个染色体异常。1p染色体缺失和17q染色体扩增最为常见，但它的临床意义并没有MYCN扩增有意义。11q染色体的缺失较少见，如果同时伴MYCN扩增，更有临床意义。在新的神经母细胞肿瘤国际分期和危险度分级中，11q染色体的缺失也作为提示年龄小于18个月的婴幼儿预后差的因子之一[8-9]。(3)基因表达异常：神经母细胞肿瘤中，很多基因表达上调或下调，可能与预后相关。与预后密切相关是MYCN扩增，但仅约20%的肿瘤具有MYCN扩增，其余基因包括：59-基因标记、199-基因标记等。目前，由于RNA在肿瘤中的不稳定性，基因标记还未被临床采纳作为评估预后的因子。(4)TrkA、CD44、ALK、Glut1：与NB相关的TRK基因家族，包括TRKA、TRKB和TRKC，他们在NB的进展中起不同作用。NB的分化过程中TRKA高表达，提示其预后较好，且可以下调MYCN[10]。CD44在很多组织中均有表达，包括GNB和约50%的未分化NB。CD44的表达且无MYCN扩增，提示预后较好，CD44失表达提示预后差[11]。ALK被认为是NB的易感基因之一，在进展期的NB和乏基质的NB中有过表达现象，特别是在伴MYCN扩增时，提示预后差，且活化的ALK受体可以作为小分子抑制剂的靶点用于肿瘤的靶向治疗[12-13]。Glut1在NB和nGNB中存在过表达，提示患者预后较差[14]。

3.4预后判断肿瘤预后重要指标有患者年龄、临床分期和MYCN扩增。随着患者年龄增大，肿瘤的转移风险提高及预后较差。小于12个月的NB患者，一般无MYCN扩增，大部分为自然消退，预后较好；大于18个月的NB患者，提示预后较差；大于12岁的NB患者10年生存率较低(<10%)[9]。临床、病理医师诊断时，需综合考虑肿瘤分型(Shimada标准)及分子遗传学改变等其他因素。iGNB任何年龄段的预后均较好，且无MYCN扩增，预后与GN相似[15]。

综上所述，正确认识神经母细胞肿瘤的组织学形态及免疫表型，并结合其生物遗传学改变为患者治疗提供更多的临床依据，对预测该肿瘤的生物学行为及预后非常重要。

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Childrenperipheralneuroblastictumor:pathology,biologyanditsclinicalsignificance

XU Ke-chun, GUAN Wen-bin, XU Yan-chun, WANG Xiao-ying , WANG Li-feng, ZHU Ming-jie

(DepartmentofPathology,XinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)

PurposeTo summarize the histological, immunophenotypic feature and MYCN (MYC gene) amplification results of peripheral neuroblastic tumours in children,and to predict its biological behavior and prognosis.MethodsThe histology and immunophenotype of 100 cases of neuroblastoma (NB) and ganglioneuroblastoma (GNB) were retrospectively analysed, MYCN status was detected in 60 cases.ResultsAmong The average age of 100 cases of GN and GNB was 2.7 years old, and that of males was more than that of females. NB could be divided into three subtypes: undifferentiated, poorly differentiated and differentiating. GNB could be divided into two subtypes: intermixed (iGNB) and nodular (nGNB). Immunohistochemical staining showed neuroblastoma cells were positive for NSE, NF, PGP9.5, Syn, CgA in varying degree. Schwann cells were positive for S-100 and GFAP. MYCN amplification was detected in 11.67% of the cases, and no MYCN amplification was seen in iGNB patients.ConclusionThe diagnosis of peripheral neuroblastic tumours is mainly based on histological morphology, special tests (immunohistochemistry, electron microscope and cytogenetics) can helpful for identifing undifferentiated neuroblastoma cells. The prognosis of neuroblastoma derived tumors is evaluated according to the age of patients, the classification and staging of tumors, and molecular genetic alterations.

neuroblastoma； ganglioneuroblastoma； diagnostic criteria； biology； prognosis

时间：2017-7-18 11:51 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.009.html

上海交通大学医学院附属新华医院病理科，上海 200092

许恪淳，女，硕士，主治医师。E-mail: xukechun@xinhuamed.com.cn 祝明洁，女，硕士，副主任医师，通讯作者。E-mail: m-jzhu@hotmail.com

R 739.4

:A

:1001-7399(2017)07-0746-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.009

接受日期：2017-05-19