HOTAIR-siRNA通过miR-21对肝癌侵袭、转移的影响

王永玲，高建芝，闫姝洁，王 琼，韦立新

HOTAIR-siRNA通过miR-21对肝癌侵袭、转移的影响

王永玲1，高建芝2,3，闫姝洁2，王 琼3，韦立新3

目的探讨长链非编码HOTAIR靶控miR-21对肝癌细胞侵袭的影响及相关机制。方法采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术检测30例肝癌组织中miR-21的表达，及其与临床病理特征的相关性；HOTAIR的siRNA转染人肝癌HepG2细胞，采用Transwell小室法检测HepG2细胞的侵袭活性；应用qRT-PCR法检测HepG2细胞中miR-21的表达；采用Western blot法检测MMP-2蛋白的表达，并分析其与miR-21的相关性。结果qRT-PCR检测发现miR-21在肝癌组织中的表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05)；miR-21表达与肿瘤恶性程度、分化程度及侵袭转移均呈正相关；与患者AFP、肿瘤大小及肿瘤数目无关。沉默HOTAIR基因后，HepG2细胞侵袭能力下降，miR-21基因和MMP-2蛋白的表达均下调且两者呈正相关。结论miR-21在肝癌组织中呈高表达，并与肝癌恶性程度、肿瘤分化、门静脉癌栓及侵袭转移有关；HOTAIR可能通过靶控miR-21的表达抑制肝癌细胞的侵袭与转移。

肝肿瘤；长链非编码RNA；miR-21；侵袭和转移；MMP-2

原发性肝癌是病死率极高的恶性肿瘤之一，除早期手术切除外，采用放、化疗均不能取得较好疗效。目前，诸多学者从生物学角度寻找治疗肝癌的靶点。研究表明，HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)在结直肠癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤组织中的表达水平与其转移、复发及预后呈正相关[1-4]。文献报道，lncRNA和miRNA之间的关系密切，miRNA可通过作用于lncRNA影响肿瘤的发生、发展；lncRNA也可作为miRNA的前体，加工成miRNA后发挥作用。其中短链非编码RNA-21(miR-21)位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域，是具有自主转录功能的miRNA，在胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等肿瘤中呈过表达，且与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关[5-8]。目前，关于miR-21对肝癌细胞侵袭、转移相关信号蛋白的调节作用及其机制是否与长链非编码HOTAIR的调控尚不清楚。本文应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术检测miR-21在肝癌中的表达及与临床病理特征的关系，并将HepG2细胞的HOTAIR基因沉默，观察肝癌细胞生物学行为的变化、miR-21基因和MMP-2蛋白的表达及两者的相关性，探讨HOTAIR靶控miR-21的表达对肝癌细胞侵袭、转移相关信号蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织样本 收集2012年9月～2013年5月解放军301医院手术切除的30例肝癌标本及对应癌旁组织，所有患者术前均未行放、化疗，肝癌组织经病理确诊为肝细胞癌；癌旁组织来源于距离肿瘤边缘3 cm以上的未侵袭组织。所取组织标本立即于液氮中保存，提取RNA备用。所有组织标本均已获得患者同意，并签署知情同意书。

1.1.2细胞系 HepG2人肝癌细胞系由中国人民解放军总医院消化内科实验室提供。

1.1.3主要试剂及材料 胎牛血清购自浙江天杭公司；Transwell小室购自加拿大Costar公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Introgen公司；Trizol购自上海世仪公司；逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；用Primier 5.0软件设计各基因的引物序列，全部引物序列由北京三博远志公司合成。兔抗鼠PTEN、MMP-2抗体及GADPH抗体均购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR检测肝癌组织miR-21的表达及转染后细胞miR-21的表达 按Trizol试剂盒说明书提取肝癌组织或细胞总RNA，紫外分光光度计测定其纯度及浓度，取比值为1.8～2.0之间的RNA进行逆转录。根据TaKaRa试剂盒说明书将miR-21逆转录为相应的cDNA，反应温度：42 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，置于4 ℃备用。应用qRT-PCR技术检测miR-21在肝癌组织及癌旁组织中的表达(高表达：肝癌组织表达水平较癌旁组织高；低表达：肝癌组织表达水平较癌旁组织低)、干扰HOTAIR的HepG2中miR-21的表达。hsa-miR-21-5p的引物序列为5′-GGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTG-3′；miRNU6-2(内参U6)的引物序列为：5′-CTGCGCAAGGATGACACGC-3′。反应条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，合计45个循环。每个实验重复3次。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.2.2细胞培养及siRNA干扰试验 HepG2肝癌细胞用含100 mL/L胎牛血清和双抗的DMEM 培养基在37 ℃ 5%CO2的培养箱中培养。转染前24 h将HepG2细胞接种于12孔板中，按Lipofectamine 2000的说明书进行操作，将Lipofectamine 2000与HOTAIR的siRNA混匀，室温放置20 min加入培养HepG2的培养皿中继续培养，qRT-PCR技术检测siRNA的干扰效率。control siRNA作为对照组。

1.2.3Transwell小室法检测细胞侵袭能力 将融化后Matrigel基质胶用DMEM培养基稀释后加100 L于Transwell小室的上室，37 ℃培养箱中孵育5 h使Matrigel胶凝固，将干预48 h后的细胞胰酶消化，用含10 mL/L FBS DMEM培养基重悬细胞并配成每毫升105个细胞悬液，把该细胞悬液加入200 L于上室，下室加入200 mL/L FBS的DMEM培养基600 L，37 ℃ 5%CO2培养箱孵育24 h，用棉签轻轻拭去滤膜上表面未穿过的细胞，4%多聚甲醛固定，1 g/L结晶紫染色，PBS冲洗后进行高倍显微镜下计算细胞数(每小室随机取5个视野)，以计数穿膜细胞数目来间接反映肿瘤细胞侵袭能力。

1.2.4Western blot检测细胞MMP-2的表达 移去培养液，用1 mL预冷的1×PBS冲洗细胞，移去PBS，加入裂解液4 ℃过夜；采用BCA蛋白检测试剂盒对各组细胞蛋白进行定量。按照每孔30 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭1 h，分别加入按1 ∶2 000比例稀释MMP-2，一抗4 ℃孵育过夜；1 ∶20 000二抗(山羊抗小鼠IgG HRP)常温下孵育2 h行显色、曝光、胶片扫描、定量分析。用Image J图像分析软件分析各条带的灰度值，以目的蛋白对GAPDH相对值记录结果，各标本重复3次，取平均值。

1.3统计学分析采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 19.0软件进行统计学处理，符合正态分布的计量资料以表示。采用χ2检验法评估miR-21表达水平与肿瘤的复发及临床病理特征之间的关系，采用Spearman进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-21的表达与肝癌临床病理特征的相关性miR-21的高表达与肝癌恶性程度、肿瘤分化、门静脉癌栓及侵袭转移均相关(P<0.05)；与患者肿瘤大小、数目及肿瘤标志物AFP等均无关(P>0.05，表1)。

表1 miR-21与肝癌临床病理特征的相关性

*P<0.05

2.3HOTAIR-siRNA干扰效果检测及对肝癌细胞侵袭能力的影响qRT-PCR检测结果显示，HepG2细胞转染HOTAIR-siRNA后，HOTAIR mRNA表达较对照组明显下调(P<0.05)，提示转染成功(图1)。与对照组相比，HOTAIR-siRNA组侵袭出的细胞数明显降低(P<0.05，图2)。

图1 实验各组HOTAIR mRNA的表达水平

AB

图2HOTAIR-siRNA对肝癌细胞侵袭能力的影响：A.对照组；B.HOTAIR-siRNA

2.4HOTAIR-siRNA转染后可下调肝癌细胞中miR-21的表达qRT-PCR检测结果显示，HepG2细胞转染HOTAIR-siRNA后，miR-21表达量明显低于对照组(P<0.05，图3)。

图3 实验各组miR-21的表达水平

2.5HOTAIR-siRNA转染后MMP-2的表达及与miR-21的相关性Western blot结果表明，HOTAIR-siRNA组MMP-2表达量明显低于对照组(P<0.05，图4)。肝癌细胞中MMP-2与miR-21的表达量之间呈正相关(R2=0.83)。

图4 实验各组MMP-2的蛋白表达

3 讨论

非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是无编码蛋白质，在生物体内广泛存在，是对生命活动发挥重要调控作用的RNA。根据ncRNA大小、结构和功能的不同将其分为miRNA、Piwi相互作用RNA(piRNA)和lncRNA等类型[9]。其中lncRNA和miRNA在肿瘤发生、发展的作用是近年学者研究的热点。lncRNA是一类转录本长度大于200 bp的非编码RNA，主要通过遗传学调控、转录调控、转录后调控等实现对基因表达的调控[10]。HOTAIR是Rinn小组于2007年发现的以反式作用调控基因表达的lncRNA。大量研究表明，HOTAIR在结肠癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，并与肿瘤的转移、复发及其预后密切相关。本组结果证实，肝癌组织中HOTAIR的表达明显增高。

miR-21是内源性长度约22 nt的非编码单链RNA，被视作原癌基因，其在多数肿瘤如胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等组织中过表达，与肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等关系密切[5-8]。本组结果显示：miR-21在肝癌组织中呈高表达，与以往的报道一致。随着分析的深入，发现lncRNA和miRNA之间存在相互调节，lncRNA也可以作为竞争性内源性RNA作用于miRNA，参与靶基因的表达调控，并在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。miRNA也可能通过作用于lncRNA，从而实现对lncRNA的调控，在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色。本组结果显示，miR-21在肝癌组织中的表达量呈正相关，并与肝癌恶性程度、肿瘤分化、门静脉癌栓及侵袭转移有关，提示miR-21的高表达极有可能是引起肝癌的肿瘤增长及生物学行为恶性改变的主要原因。

为了进一步确定HOTAIR在肝癌发生、发展中的作用及与对miR-21的调控有关，本实验用siRNA沉默肝癌细胞中HOTAIR基因，应用qRT-PCR检测肝癌组织中miR-21的表达，发现肝癌组织中miR-21表达下调。同时，Transwell实验证实敲除HOTAIR基因后，miR-21低表达可以抑制肝癌细胞株HepG2的侵袭，进一步揭示miR-21具有促进肝癌细胞侵袭的作用。

MMP-2是基质金属蛋白酶家族中最重要的成员，具有降解细胞外基质，促进新生血管形成，调节细胞间黏附等作用进而促进肿瘤发生侵袭和转移[11]。通过对侵袭因子MMP-2的检测发现：沉默HOTAIR基因后，MMP-2蛋白的表达量明显下降，并与miR-21的表达呈正相关，提示miR-21的下调可以通过减少MMP-2蛋白的表达进而抑制肝癌细胞的侵袭转移。

综上所述，miR-21在肝癌中呈高表达，并与肝癌恶性程度、肿瘤分化、门静脉癌栓及侵袭转移有关。长链非编码HOTAIR可能通过靶控miR-21的表达水平进而抑制肝癌细胞侵袭、转移。因此，HOTAIR可能作为肝癌诊断和判断预后的重要标志物，也为其复发转移治疗提供潜在靶点和新的治疗思路。

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EffectofHOTAIR-siRNAoninvasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabymiR-21

WANG Yong-ling1, GAO Jian-zhi2,3, YAN Shu-jie2, WANG Qiong3, WEI Li-xin3

(1BasicMedicalCollegeofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;2DepartmentofOncology,HospitalofZhuozhouCity,Zhuozhou072750,China;3DepartmentofPathology,GeneralHospitalofthePeople’sLiberationArmy,Beijing100080,China)

PurposeTo study the role of lnc-HOTAIR and its target-controlled miR-21 on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells (HCC) and its related mechanisms.MethodsThe expression of miR-21 in 30 cases of HCC was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and correlation with clinical pathology was also analyzed. siRNA of lnc-HOTAIR was transfected to HCC HepG2 cell (HepG2), invasive activities of HepG2 was detected by Transwell, the expression of miR-21 was determined by qRT-PCR, the expression of protein MMP-2 was determined by Western blotting, and the correlation with miR-21 expression was analyzed.ResultsCompared with pericarcinous tissue, the expressions of miR-21 in tumor tissue increased apparently (P<0.05). The expressions of miR-21 correlated positively with malignancy degree, differentiation degree and invasion and metastasis respectively, and correlated negatively with tumour size, tumour number and level of AFP respectively. After silencing the HOTAIR gene, the invasive activities of HepG2 were suppressed, the expression of miR-21 gene and MMP-2 protein were down regulated, and both of them were positively correlated.ConclusionHigh expressions of miR-21 in liver cancer correlate positively with malignancy degree, differentiation degree, intrahepatic and extrahepatic metastases and portal vein tumor thrombus respectively. HOTAIR may inhibit the invasion and metastasis of HCC by controlling the expression level of miR-21.

hepatocellular neoplasm； lncRNA； miR-21； invasion and metastasis； MMP-2

时间：2017-7-18 11:51 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.003.html

全国博士后56批二等资助(20140435)、河北省保定知识产权局资助(15ZF062)

1新乡医学院基础医学院，新乡 4530032中国人民解放军总医院合作医院涿州市医院肿瘤科，涿州 0727503中国人民解放军总医院病理科，北京 100080

王永玲，女，硕士，副教授。E-mail: 838387815@qq.com 高建芝，女，博士后，副主任医师，副教授，通讯作者。 E-mail: gaoteng.bao@163.com

R 735.7

:A

:1001-7399(2017)07-0720-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.003

接受日期：2017-05-24