金花葵花总黄酮的提取及体外抗氧化活性

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(辽宁石油化工大学,化学化工与环境学部,辽宁抚顺 113001)

金花葵花总黄酮的提取及体外抗氧化活性

王菲,孙一焱,解长海,宋力,孙志宇,孙家龙，陆光

(辽宁石油化工大学,化学化工与环境学部,辽宁抚顺 113001)

采用响应面法对金花葵花总黄酮的溶剂提取条件进行优化,并通过人工构建自由基来考察金花葵花总黄酮的体外抗氧化能力。实验结果表明,金花葵花总黄酮的最适提取条件:乙醇浓度75%(V/V)、液料比30∶1,提取温度60 ℃,提取时间2.50 h,在此条件下的黄酮得率为126.67 mg/g干重。体外抗氧化实验表明:金花葵花总黄酮对超氧阴离子自由基有很强的清除能力,IC50为207.1 μg/mL,且效果优于VC;金花葵花总黄酮对DPPH自由基和羟基自由基有较强的清除作用,IC50分别为37.5 μg/mL和754.7 μg/mL,金花葵花总黄酮对Fe3+的具有一定的还原作用,是VC的83%,但均稍差于VC。金花葵花总黄酮具有较高的体外抗氧化能力。

金花葵花,总黄酮,提取,抗氧化活性

金花葵(HibiscusmanihotL.),又名金芙蓉、菜芙蓉、野芙蓉,为锦葵科秋葵属一年生草本植物[1]。金花葵花中含有黄酮、蛋白质、高聚糖胶、膳食纤维、微量元素硒、锌和多种不皂化物等,其中黄酮类化合物是主要活性成份[2]。金花葵自然分布在河北地区,是近濒临绝种的植物之一。因其功效渐被认知,目前已经有很多金花葵种植基地,多分布在太行山东部山麓地区,晋中晋南地区。金花葵花在二百多种秋葵植物中最具食用、药用价值,具有清利湿热、消炎镇痛之功效[3-5]。金花葵的油脂除能食用外,还可作为高档润滑油和加工化妆品的高级原料。现代医学研究表明,黄酮类化合物有较高的生物活性和药用价值,如抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗糖尿病、护肝、防癌、降低血管脆性、改善血管通透性、降低胆固醇和血脂、防治老年人的高血压和脑溢血等功效[6-9]。故从金花葵花中提取黄酮,研究金花葵花中黄酮的生物活性十分必要。

金花葵花中总黄酮的提取方法多采用溶剂浸提法,故找到此法的最佳提取条件至关重要。本实验以金花葵花为原料,以乙醇为溶剂,采用溶剂浸提法提取金花葵花总黄酮,通过单因素结合响应面优化实验来确定金花葵花总黄酮的最佳提取条件,并通过人工构建自由基对金花葵花总黄酮的体外抗氧化能力进行研究,为其深加工和综合开发利用提供科学理论基础。

1 材料和方法

1.1材料与仪器

金花葵花 辽宁恒生实业集团有限公司;芦丁标准品 色谱纯,合肥博美生物科技有限公司;无水乙醇、硝酸铝、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、水杨酸、过氧化氢、硫代巴比妥酸、三羟基氨基甲烷、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、盐酸 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-苦基苯肼 色谱纯,购自Sigma公司;去离子水 实验室自制。

ALC-1100.2电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DUG-9021A电热恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;All basic分析研磨机 德国IKA公司;HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;TDL-40B台式离心机 上海安亭科学仪器厂;UV-2600可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;LGJ-10型冷冻干燥机 军事医学科学院实验仪器厂研制、北京四环科学仪器厂制造。

1.2实验方法

1.2.1 金花葵花总黄酮的提取 将金花葵花置于50 ℃烘箱内进行烘干处理24 h,取出后粉碎,过60目筛,装瓶待用。准确称取金花葵花粉末若干,加入一定量不同体积分数的乙醇溶液,分别在不同的液料比、水浴时间和水浴温度下进行提取,再在4000 r/min下离心5 min,取上清液即为黄酮粗提液。

1.2.2 黄酮得率的测定 金花葵花总黄酮粗提液中黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[10-11],测定波长为510 nm,以吸光度为纵坐标,含量为横坐标,绘制标准曲线,标准曲线方程为:y=0.1633x+0.0049,R2=0.9999。按下式进行黄酮得率的计算:

式中:C-由回归线方程计算出浓度(mg/mL);D-测定液定容的体积(L);V-提取液的体积(mL);m-样品质量(g);B-吸取测定的体积(mL)。

1.2.3 金花葵花总黄酮提取条件的优化 金花葵花总黄酮提取条件的优化是采用单因素预实验结合响应面优化实验来实现的。单因素实验预实验具体实施过程是以已烘干粉碎的金花葵花粉末为原料,乙醇溶液为提取溶剂,考察不同的乙醇浓度(V/V)、液料比、提取温度和提取时间对金花葵花总黄酮得率的影响。根据单因素预实验结果,设计自变量的取值范围及实验水平,如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素与水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

1.2.4 金花葵花总黄酮的纯化 在1.2.3实验所得最优条件下制备得到粗提液,进行旋转蒸发浓缩后,进行聚酰胺柱层析纯化,上样液质量浓度为4.68 mg/mL,pH为4～5,吸附流速为1.5 mL/min,上样量为1.5 BV,以3 BV的水冲洗树脂柱,5 BV的80%乙醇溶液以1.5 mL/min的速率洗脱效果最佳,所得洗脱液经冷冻干燥后即得到金花葵花总黄酮纯化物,其纯度为75.2%。

1.2.5 金花葵花总黄酮体外抗氧化作用研究

1.2.5.1 清除DPPH自由基的测定 精确称取DPPH 9.7 mg,加入少量无水乙醇溶解后,以体积分数为95%的乙醇溶液定容至250 mL,制成浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL已配制的DPPH溶液,分别加入1 mL不同浓度的金花葵花总黄酮纯化液,以95%乙醇补足到4 mL,混匀,放置30 min后,在517 nm处测定样品吸光值As,以95%乙醇为空白对照,测定Ac[12]。以蒸馏水作参比,VC为阳性对照。按下式计算清除率及IC50。

清除率(%)=(Ac-As)/Ac×100

式中,Ac-空白的吸光度;As-样品的吸光度。

以样品浓度与清除率作图,清除率为50%时所需样品的浓度,即半数抑制浓度IC50。

清除率(%)=(Ac-As)/Ac×100

1.2.5.3 清除羟基自由基(·OH)的测定 利用H2O2与Fe2+反应产生,在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质,该物质在510 nm下有最大吸收。反应体系中含8.8 mmol/L H2O21 mL,10 mmol/L FeSO41 mL,10 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL,分别加入不同浓度金花葵花总黄酮纯化液1 mL,最后加H2O2启动反应,37 ℃反应0.5 h,在510 nm下测定样品吸光度As。空白管以1 mL蒸馏水代替样品,操作方法同上,可测得空白管的吸光度Ac[14]。以蒸馏水作参比,VC为阳性对照。按下式计算清除率及IC50。

清除率(%)=(Ac-As)/Ac×100

1.2.5.4 还原力的测定 取不同浓度的金花葵花总黄酮纯化液1 mL于试管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH=6.6)和2.5 mL质量分数1% K3Fe(CN)6混匀,于55 ℃恒温水浴中温育20 min后,迅速冷却,加入2.5 mL质量分数10%的三氯乙酸混合后,以3000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2 mL蒸馏水和0.5 mL质量分数0.1%的FeCl3溶液,充分混合,静置10 min后,于700 nm处测定样品吸光度值As,吸光度越大,表示还原能力越强[15]。空白管以1 mL蒸馏水代替样品,操作方法同上,可测得空白管的吸光度Ac。用蒸馏水作参比,VC为阳性对照。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

还原力=As-Ac

1.3数据处理

采用Design-Expert 8.05软件分析实验数据。

2 结果与分析

2.1响应面法对金花葵花总黄酮提取条件的优化

2.1.1 实验方法和设计 在单因素实验基础上,以乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间作为自变量,金花葵花总黄酮得率为响应值,进行四因素三水平Box-Behnken的中心组合实验设计。Box-Behnken实验设计及结果如表2所示。根据表2的实验结果,用Design-Expert 8.05统计分析软件进行多元回归分析,主要分析结果见表3。

经过对实验数据的多元回归分析,响应变量和实验变量的关系如下列二元多次方程:

Y=127.32-0.93A+2.10B-2.76C-0.49D-0.075AB-1.07AC-1.55AD-0.17BC+0.75BD+2.73CD-1.32A2-5.14B2-10.06C2-3.61D2

金花葵花黄酮得率的方差分析结果见表3,在本实验所涉及范围内,该模型p<0.0001,极显著。模型的决定系数R2=0.9271,说明该模型与实际实验拟合良好,误差小,证明应用响应面优化法得到的提取条件提取金花葵花黄酮是可行的。失拟项的p值是0.0839,大于0.05,不显著,表明方程的拟合不足检验不显著,本实验无其他因素的显著影响。与此同时,一个很低的变化系数值1.94%,清楚的显示出很高的精密度等级和实验值的可靠性。二次响应曲面回归方程能很好的拟合本实验所得结果,该模型可以用于金花葵花黄酮提取实验的理论预测。从p值可知,四个因素对黄酮得率的影响强弱依次为:乙醇浓度>提取时间>提取温度>液料比。各个实验因子对其响应值的影响不仅是简单的线性关系,一次项中一次项B、C对响应值的影响为极显著,交互项中CD的影响为显著,平方项中B2、C2、D2的影响为极显著。

2.1.2 响应面图解析 图1表示乙醇浓度、液料比、提取时间和提取温度中任意两个变量取零时,其余两个变量对黄酮得率的影响。

从各个因素两两相互作用的响应面图形观察发现,曲线走势越陡,其影响越显著。由响应面图和p值的分析可知,交互项CD,即乙醇浓度和液料比的响应面图走势较陡,影响显著。

2.1.3 验证实验 根据响应面分析软件的预测,得到最佳提取条件:乙醇浓度73.32%、液料比29.67∶1、水浴温度57.11 ℃、水浴时间为2.60 h,此时黄酮得率理论预测值为127.856 mg/g干重。为了检验实验结果是否与实际情况一致,故根据上述实验条件预测值进行验证实验,考虑到实际操作的便利,将提取条件修正:乙醇浓度75%(V/V)、液料比30∶1、水浴温度60 ℃、水浴时间为2.50 h。在此条件下进行三次平行实验,得到金花葵花总黄酮实际得率平均值为126.67 mg/g干重,与预测值接近,可见该模型能较好地模拟和预测实验产率。

表3 Box-Behnken实验回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance Box-Behnken test of regression equation

图1 乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间及其两两相互作用对黄酮得率影响的响应面图Fig.1 The response surface graph showing the effects of ethanol concentration,liquid to material,extraction temperature,extraction time and their interaction effect on the yield of flavonoids

注:**为极显著(p<0.01),*为显著(p<0.05)。

2.2金花葵花总黄酮的抗氧化实验研究

2.2.1 金花葵花总黄酮清除DPPH自由基能力 由图2可知,金花葵花总黄酮对DPPH自由基的清除率随浓度增大而增强,且具有明显的量效关系,VC亦是。金花葵花总黄酮对DPPH自由基的IC50为37.5 μg/mL,VC的IC50为25.1 μg/mL,说明金花葵花总黄酮对DPPH自由基的清除率稍差于VC,表明金花葵花总黄酮对DPPH自由基具有较强的清除作用。

图2 金花葵花总黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用 Fig.2 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on DPPH radical

2.2.2 金花葵花总黄酮清除超氧阴离子自由基能力 由图3可知,金花葵花总黄酮具有清除超氧阴离子自由基的作用,清除率随着黄酮浓度增大而增强,且具有明显的量效关系,VC亦是。金花葵花总黄酮的IC50为207.1 μg/mL,VC的IC50为334.6 μg/mL。说明金花葵花总黄酮对超氧阴离子自由基有的清除作用强于VC,表明金花葵花总黄酮具有很强的清除超氧阴离子自由基的能力。

图3 金花葵花总黄酮对超氧阴离子自由基清除能力Fig.3 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on superoxide anion radical

2.2.3 金花葵花总黄酮清除羟基自由基能力 由图4可知,金花葵花总黄酮具有清除羟基自由基的作用,清除率随着黄酮浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,VC亦是。金花葵花总黄酮的IC50为754.7 μg/mL,VC的IC50为673.1 μg/mL。说明金花葵花总黄酮对羟基自由基有一定的清除作用,但稍差于VC。

图4 金花葵花总黄酮对羟自由基清除能力Fig.4 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on scavenging hydroxyl radicals

2.2.4 金花葵花总黄酮的还原力 由图5可知,在一定浓度范围内,金花葵花总黄酮的还原力随浓度增大而增强,且具有明显的量效关系,VC亦是。金花葵花总黄酮浓度为200 μg/mL时,吸光度为0.835,而VC浓度为200 μg/mL时,吸光度为1.006,表明金花葵花具有较强的还原能力,但低于同浓度VC的还原力。金花葵花总黄酮还原力大约是VC还原力的83%。说明金花葵花总黄酮对Fe3+具有较好的还原作用,但稍差于VC。

图5 金花葵花总黄酮和VC的还原力Fig.5 The reducing ability of flavonoids and ascorbic acid

综上所述,金花葵花总黄酮对DPPH自由基的清除能力和对Fe3+的还原能力具有较强的作用,但稍差于VC;对超氧阴离子自由基具有很好的清除能力,且好于VC;对羟基自由基有一定的清除作用但差于VC。说明金花葵花总黄酮具有较强的体外抗氧化活性。

3 结论

金花葵花总黄酮的最适提取条件:乙醇浓度75%(V/V)、液料比30∶1,提取温度60 ℃,提取时间2.50 h,在此条件下的黄酮得率为126.67 mg/g干重。

金花葵花总黄酮的体外抗氧化活性实验表明:金花葵花总黄酮对超氧阴离子自由基具有很强的清除能力,且效果好于VC;金花葵花总黄酮具有较强的对DPPH自由基和羟基自由基的清除作用以及对Fe3+的还原作用,但稍差于VC。综上所述,金花葵花总黄酮具有较强的体外抗氧化能力。

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ExtractionoftotalflavonoidsfromHibiscusmanihotL.flowerandtheirantioxidantactivityinvitro

WANGFei,SUNYi-yan,XIEChang-hai,SONGLi,SUNZhi-yu,SUNJia-long,LUGuang

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Environmental Engineering,Liaoning Shihua University,Fushun 113001,China)

This test used solvent extraction of flavonoids fromHibiscusmanihotL. flower by using response surface methodology to optimize the extraction conditions,and the antioxidant activityinvitrowas evaluated by artificial free radicals in detail. The optimal extraction conditions were as follows:the volume fraction of ethanol 75%,ratio of liquid to solid 30∶1,extraction temperature 60 ℃,extraction time 2.5 h. Under this optimum conditions,the actual yield of flavonoids was 126.67 mg/g dry weight. The total flavonoids inHibiscusmanihotL. flower had a good scavenging effect on superoxide anion radical with a 50% inhibition concentration(IC50)of 207.1 μg/mL and which was better than that of ascorbic acid. The extracts also had a good scavenging effect on DPPH radical and hydroxyl radical with IC50of 37.5 μg/mL and 754.7 μg/mL respectively,which were a little lower than that of ascorbic acid. The extract also showed a certain reduction ability and it was 83% times as much as that of ascorbic acid. In general,total flavonoids fromHibiscusmanihotL. flower had a high antioxidant activity.

HibiscusmanihotL. flower;total flavonoids;extraction;antioxidant activity

2017-02-07

王菲(1982-)，女，博士，讲师，主要从事食品生物技术方面研究，E-mail:107806708@qq.com。

辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2016006)。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)16-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.035