响应面法优化酶解制备核桃多肽工艺

2017-09-18佳益

食品工业科技 2017年16期

关键词：分子量多肽蛋白酶

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(山西大学生命科学学院,山西太原 030006)

响应面法优化酶解制备核桃多肽工艺

陈树俊,李乐,石玥,胡洁,徐晓霞,李佳益,张君梅,王翠连

(山西大学生命科学学院,山西太原 030006)

核桃,多肽,响应面法,工艺优化,抗氧化活性

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃、羌桃、万岁子等,属于胡桃科核桃属植物[1],不仅富含优质脂肪、蛋白质、碳水化合物、维生素[2],还有丰富的卵磷脂、氨基酸及不饱和脂肪酸,不含胆固醇,而且味美可生食,可作为多种食品辅料,是一种优良的滋补品[3]。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白资源,其中含有18种氨基酸,精氨酸和谷氨酸含量很高[4],其酶解产物核桃生物活性多肽是目前的研究重点[5],具有浓度高、溶解性好、抗氧化性强等特性[6],是很好的生产高蛋白流体的食品原料,此外,核桃肽还可做发酵火腿、酸奶以及风味酒等发酵食品的原料或添加剂[7]。已有相关研究报导:高瑞雄[8]等选用纳豆芽孢杆菌对冷榨核桃粕进行液态发酵制得了核桃多肽；宗玉霞[9]以核桃粕为原料,经木瓜蛋白酶水解后,得到了核桃多肽水解液饮料；王端[10]等以脱脂核桃粉为原料,对其进行酶解从而成功制备出核桃多肽。目前我国核桃制品仍以干果及其粗加工品为主[11],营养物质利用程度不高[12]。核桃的深加工产品较少,如何有效的利用核桃的营养物质及其药用成分不仅可以拓展核桃的利用途径,还可以促进当地经济发展,提高农民收入。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

核桃粉蛋白含量84.79%,山西大学生物工程基础实验室自制;中性蛋白酶(60000 U/g)、酸性蛋白酶(50000 U/g)、碱性蛋白酶(200000 U/g)、木瓜蛋白酶(800000 U/g)、风味蛋白酶(20000 U/g) 食品级,Solarbio北京索莱宝科技有限公司;酪蛋白磷酸肽CPP(Gly-Gly-Tyr-Arg) Sigma公司;甲醛溶液 36%～40%,成都市科龙化工试剂厂;总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒南京建成生物工程有限公司;2,2-二苯代苦味酰基苯肼自由基(DPPH·) Sigma公司;氢氧化钠、三氯乙酸、铁氰化钾、无水乙醇、磷酸二氢钠、邻苯三酚、磷酸氢二钠、盐酸、三氯化铁等均为分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司。

JYL-c010料理机九阳股份有限公司;B25 Series实验室分散乳化均质机上海贝而特机电设备科技有限公司;WFZ UV-2100型紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司;Labscale TFF System小型切向流超滤系统美国Millipore公司;全不锈钢HH-M8八孔恒温水浴锅上海赫田科学仪器有限公司;电子分析天平上海卓精公司;SC-3610低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司;FE20实验室pH计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;81-2型恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂;其它为常规仪器。

1.2实验方法

1.2.1 磨浆及评价指标磨浆过程能够使蛋白质溶出,这在很大程度上增加了蛋白水解酶的作用位点,为后续酶解提供基础条件。以蛋白溶出率为指标,将高蛋白核桃粉与水以一定比例(料液比分别为1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22 g/mL)通过料理机进行搅拌(16000 r/min,30 s),再转移至实验室高剪切分散乳化均质机中进行剪切(18000 r/min,3 min),得到核桃浆。

蛋白质质量根据GB/T 5009.5-2010进行测定,按照下式计算蛋白质溶出率。

蛋白质溶出率(%)=核桃浆蛋白质总质量/核桃粉蛋白质总质量×100

1.2.2 核桃蛋白酶解工艺

1.2.2.1 蛋白酶的选择以多肽质量浓度和水解度为指标,在加酶量7000 U/g,温度45 ℃,pH 7.00,时间3 h条件下分别用中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对核桃浆进行酶解,比较4种酶的酶解效果,选出适宜的蛋白酶。

在酶总量7000 U/g及其它条件不变的前提下,分别将两种最适蛋白酶按照1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1复配,对核桃浆进行酶解。蛋白酶在酶解过程中会产生一些苦味肽,因此在确定最适复配比后与风味蛋白酶(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)协同水解去除苦味,改善口感。

1.2.2.2 酶解单因素实验设计以多肽质量浓度和水解度为指标,选取pH(6.60、6.80、7.00、7.20、7.40、7.60)、温度(35、40、45、50、55、60 ℃)、加酶量(4000、5000、6000、7000、8000、9000 U/g)、时间(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h)4因素进行单因素实验。酶解初始条件pH 7.00,温度45 ℃,加酶量7000 U/g,时间3.0 h,控制变量法进行单因素条件筛选。

1.2.2.3 酶解响应面实验设计根据单因素实验结果,结合Box-Behnken中心组合实验设计原理,以多肽质量浓度和水解度两个指标为响应值,选取pH、温度、加酶量、时间4因素,采用Design-Expert V 8.0.6.1软件进行4因素3水平响应面优化实验,因素及水平设计见表1。

表1 中心组合实验因素及水平Table 1 Factors and levels of central composite experiment

1.2.2.4 蛋白酶解效果指标测定水解度测定:氨基酸态氮含量根据GB/T 5009.39-2003中甲醛滴定法测定,按照下式计算水解度(DH)。

多肽质量浓度测定:用三氯乙酸水溶液(TCA,50 mg/mL)先后配制成0.000、0.172、0.344、0.516、0.688、0.860、1.032、1.204、1.376和1.548 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg(酪蛋白磷酸肽)四肽标准溶液,分别定容于10 mL容量瓶中,分别移取上述标准溶液6.0 mL与4.0 mL双缩脲试剂混合均匀,静置10 min,2000 r/min离心10 min,取上清液在540 nm下测定OD值(第一管做空白对照)。以肽质量浓度为横坐标x(mg/mL),OD值为纵坐标y制作标准曲线,得到公式:y=0.1351x+0.0092,R2=0.9947。

移取2.5 mL样品溶液,加入2.5 mL 100 mg/mL三氯乙酸(TCA)水溶液,漩涡混合仪上混合均匀,静置10 min。4000 r/min离心15 min,上清液用50 mg/mL TCA水溶液定容至25 mL容量瓶,摇匀[18-19]。再按照标准品实验方法进行测定,对照所求标准曲线,即可得出样品溶液中多肽质量浓度(mg/mL)。计算公式为:

式中:C为标准曲线中得到的多肽质量浓度(mg/mL)。

1.2.3 不同分子量核桃多肽制备将最佳酶解条件下得到的核桃蛋白酶解液12000 r/min离心20 min,取上清液,经小型切向流超滤系统依次通过5、10和30 kDa分子量的超过滤膜进行分离,具体操作步骤按照说明书进行,依次制备分子量为≤5、5～10、10～30和≥30 kDa核桃多肽溶液。

1.3数据处理

本实验中应用Excel和Origin 6.0软件进行分析作图,各组实验重复三次,以平均值±标准偏差来表示,响应面设计与分析采用Design-Expert V 8.0.6.1软件。

2 结果与分析

2.1核桃磨浆料液比的确定

如图1所示，随料液比增大，蛋白质溶出率呈现逐渐上升的趋势，当料液比达到1∶20 g/mL时，蛋白质溶出率变化开始趋于平缓，说明此时通过磨浆大部分核桃蛋白质已基本溶出，达到最佳磨浆效果，再继续加大料液比溶液过稀导致蛋白质量浓度过低不利于后续酶解操作，综合考虑选取料液比1∶20 g/mL,此时蛋白质量浓度为3.62 g/100 mL。

图1 不同料液比对蛋白质溶出率的影响Fig.1 Effect of walnut-to-water on dissolution rate of protein

2.2核桃蛋白酶解工艺实验结果

2.2.1 蛋白酶的选择由图2可知,从多肽质量浓度和水解度两个指标来看,碱性和木瓜蛋白酶的水解效果均高于中性和酸性蛋白酶,经中性蛋白酶酶解的核桃浆颜色变暗,且有异味,酸性蛋白酶水解效果较差,故选择碱性和木瓜蛋白酶进行复配。如图3所示,碱性和木瓜蛋白酶的复配起到了“协同增效”的作用[21],且在碱性与木瓜蛋白酶复配比例为1∶1时多肽质量浓度和水解度均达到最高,因此最佳配比确定为1∶1。由于核桃浆在蛋白酶解过程中会产生一些苦味肽,风味蛋白酶的添加可以切断苦味肽键,从而改善蛋白液的口感[21]。图4为不同风味蛋白酶添加量的水解效果,可以明显看出风味蛋白酶添加量从2000 U/g起,再添加酶量并不能提高水解效果,故最终确定风味蛋白酶添加量为2000 U/g。

图2 不同蛋白酶的水解效果Fig.2 Effect of different protease on hydrolysis

图3 碱性和木瓜蛋白酶不同复配比例的水解效果Fig.3 Effect of mixing ratios of the alkaline protease and papain on hydrolysis

图4 风味蛋白酶不同添加量的水解效果 Fig.4 Effect of dosage of flavourzyme on hydrolysis

2.2.2 酶解单因素实验结果

2.2.2.1 pH对多肽质量浓度和水解度的影响如图5所示,随pH增大,多肽质量浓度和水解度均呈现先增后减趋势,这是由于每一种酶都有其适应的pH范围,偏酸或偏碱都会破坏酶结构,影响酶与底物相互作用[22]。在pH为7.0时多肽质量浓度达到最大值7.50 mg/mL,水解度也达到最大值10.06%,因此选择最适pH 7.0。

图5 pH对多肽质量浓度和水解度的影响Fig.5 Effect of pH on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.2 温度对多肽质量浓度和水解度的影响如图6所示,在一定温度范围内,提高温度会使多肽质量浓度和水解度增加,升温会提高分子运动程度,增大酶与底物的碰撞几率从而加速酶促反应;但酶也是蛋白质,温度过高会破坏酶分子结构从而失活使多肽质量浓度和水解度降低,在50 ℃时多肽质量浓度达到最大值8.07 mg/mL,水解度达到最大值11.15%,因此选择最适温度50 ℃。

图6 温度对多肽质量浓度和水解度的影响Fig.6 Effect of temperature on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.3 加酶量对多肽质量浓度和水解度的影响如图7所示,酶解液多肽质量浓度和水解度随加酶量加大而增大,达到8000 U/g时,变化平缓。原因可能是,酶量的增加能够促进酶解反应的进行,但底物是有限的,当酶量达到饱和时,过多的酶未能参加反应,反而给酶解液带来杂质[6],考虑到节约成本,提高多肽质量的因素,最适酶量定为8000 U/g,此时多肽质量浓度8.69 mg/mL,水解度11.45%。

图7 加酶量对多肽质量浓度和水解度的影响Fig.7 Effect of different enzyme volume on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.4 时间对多肽质量浓度和水解度的影响如图8所示,从2.5 h到3.0 h,多肽质量浓度和水解度增加比较明显,继续延长时间多肽质量浓度和水解度变化趋于平缓,这是由于产物浓度的增加抑制了反应的进行[6]。为了节省能源、降低成本,在生产过程中选择最适时间3.0 h,此时多肽质量浓度7.77 mg/mL,水解度9.71%。

图8 时间对多肽质量浓度和水解度的影响Fig.8 Effect of different time on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.3 响应面实验结果对表2多肽质量浓度(Y1)和水解度(Y2)的实验数据进行多元回归拟合后,得到核桃蛋白酶解的多肽质量浓度和水解度对pH(A)、温度(B)、加酶量(C)、时间(D)各因素变量的二次多元回归方程分别为:

表2 响应面实验方案与结果Table 2 Response surface experimental design and test results

表3 回归模型方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression model

注:***差异极显著,p<0.001;**差异高度显著,p<0.01;*差异显著,p<0.05。

2.2.4 各因素交互作用的响应面分析根据各二次回归方程可以做出响应面分析图,可以直观反映出各自变量和所拟合的响应面形状对各响应值的影响。

图9 四因素对多肽质量浓度的响应曲面图Fig.9 Response surface of four factors on peptide mass concentration

2.2.4.1 各因素交互作用对多肽质量浓度的响应曲面分析各因素交互作用对多肽质量浓度影响的响应曲面以及等高线如图9所示,由图9(a)可知,以加酶量和时间为中心水平值时,样品多肽质量浓度随着温度和pH的增加呈现先上升后下降趋势,等高线较密集,且呈现为椭圆形,表明温度和pH交互作用显著。由图9(c)可知,以温度和加酶量为中心水平值时,样品多肽质量浓度随pH增加先上升后下降,随时间上升而后趋于平缓,等高线呈椭圆形,表明时间和pH交互作用显著。

2.2.4.2 各因素交互作用对水解度的响应曲面分析各因素交互作用对水解度影响的响应曲面以及等高线如图10所示,由图10(a)可知,样品水解度随着温度和pH增大呈现先上升后下降趋势,且等高线较为密集,接近椭圆形,说明温度和pH交互作用对水解度影响显著。由图10(e)可知,样品水解度随时间增大而先上升后趋于平缓,等高线接近椭圆形,表明温度和时间交互作用对水解度影响显著。

图10 四因素对水解度的响应曲面图Fig.10 Response surface of four factors on degree of hydrolysis

2.2.5 验证实验实验结果经Design-Expert优化后得到了两个模型的最优条件:pH7.11,温度51.36 ℃,加酶量7998.11 U/g,时间3.05 h,此时多肽质量浓度理论值最高为10.11 mg/mL,水解度理论值为11.72%。为验证最佳实验结果的准确性,考虑到实际操作条件的可行性,设定最优条件为:pH 7.10,温度50 ℃,加酶量8000 U/g,时间3.0 h,在此条件下进行三次重复实验后测得多肽质量浓度平均值为10.01 mg/mL,水解度平均值为11.45%,与理论值接近,说明经过响应曲面法得到的优化工艺参数可靠性较高,与实际情况相符合,具有一定的应用价值。

2.3 不同分子量多肽抗氧化活性比较

2.3.1 不同分子量多肽质量分数由表4可知,酶解液经超滤分离得到4种分子量多肽液,其中≤5 kDa分子量多肽液占多肽液的64.94%,质量分数最高,其次是5～10 kDa、≥30和10～30 kDa分子量多肽。

表4 不同分子量多肽的质量分数Table 4 The mass fraction of different molecular peptides

2.3.2 还原力分析不同分子量多肽还原力均随多肽质量浓度增加而增大,且增加幅度相近,对多肽质量浓度和吸光度值进行线性拟合,以多肽质量浓度为x,吸光度值为y,得到各分子量多肽还原力的线性回归方程如表5所示,通过IC50的对比,可以得出还原力强弱顺序依次是:≤5、10～30、≥30和5～10 kDa分子量多肽。

表5 不同分子量多肽还原力分析Table 5 Determination of reducing power of different molecular peptides

2.3.3 DPPH·清除能力分析 4种分子量多肽的DPPH·清除率均随多肽质量浓度增加而增大,以多肽质量浓度为x,DPPH·清除率为y,得到各分子量多肽对DPPH·清除率线性回归方程如表6所示,≤5 kDa的多肽增加趋势高于其它三种多肽。由表6中IC50的对比可以得出DPPH·清除能力强弱顺序依次是:≤5、≥30、5～10和10～30 kDa分子量多肽。

表6 不同分子量多肽DPPH·的清除能力分析Table 6 Determination of DPPH· scavenging capacity of different molecular peptides

2.3.4 ·OH清除能力分析以多肽质量浓度为x,·OH清除率为y,4种分子量多肽对·OH清除率线性回归方程如表7,可以看出≥30 kDa的多肽增加趋势不如其它三种多肽,通过IC50的计算得出·OH清除能力强弱顺序依次是:≤5、5～10、10～30和≥30 kDa分子量多肽。

表7 不同分子量多肽·OH的清除能力分析Table 7 Determination of ·OH scavenging capacity of different molecular peptides

表8 不同分子量多肽的清除能力分析Table 8 Determination of · scavenging capacity of different molecular peptides

2.3.6 总抗氧化能力分析按照试剂盒方法对四种分子量多肽进行总抗氧化能力的测定,保证各分子量多肽质量浓度均为10 mg/mL,测定结果见表9,四种分子量的多肽都有一定的总抗氧化能力,且≤5 kDa的多肽总抗氧化能力最强,为14.18 U/mL。

表9 不同分子量多肽总抗氧化能力测定结果Table 9 Total antioxidant capacity measurement results of different molecular peptides

3 结论与讨论

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Optimizationofenzymatichydrolysisofwalnutpeptidebyresponsesurfacemethodology

CHENShu-jun,LILe,SHIYue,HUJie,XUXiao-xia,LIJia-yi,ZHANGJun-mei,WANGCui-lian

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)