彝药双參多糖的含量测定

王晓芳，梅桢，杨艾，杨莉萍

昆明卫生职业学院

彝药双參多糖的含量测定

王晓芳，梅桢，杨艾，杨莉萍

昆明卫生职业学院

目的研究彝族药双參中多糖含量的测定方法。方法以葡萄糖为对照，以苯酚-浓硫酸为显色剂，采用分光光度法于波长488nm处测定多糖含量。结果葡萄糖在20～120ug/ml范围内线性关系良好,线性回归方程为A=0.0075c+0.0197,r=0.999 6,平均回收率为100.87%,RSD为2.15%（n=9）。测得双參中多糖含量为25.82%～41.24%。结论表明双参中多糖含量较高,具有开发利用价值。

双参；多糖；苯酚-浓硫酸比色法

双参为川续断科植物双参Triplostegia glandulifera Wall.ex DC.的干燥块根，又称萝卜参、对对参、童子参[1]。是一味彝医的特色用药,味苦，性温，有益肾养肝，健脾宁心之功效，可用于肝肾亏虚，腰膝痠软，头晕乏力，不孕不育，月经不调，心悸失眠等症[1,2]。动物实验表明，双参具有明显的抗应激和降血糖的作用[3,4]。本实验用超声提取法从双参中提取多糖,采用苯酚-浓硫酸法测定其含量。

1.仪器与试剂

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京谱析通用仪器有限责任公司）；SK8200H超声仪（上海科岛超声仪有限公司）；AL204-IC电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。双参药材经昆明卫生职业学院药剂教研室黄鹰老师鉴定；葡萄糖对照品（上海伯奥生物科技有限公司，编号A1262）；其它试剂均为分析纯。

2.实验方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 双参多糖的提取与精制称取双参粉末30g，置圆底烧瓶中，加石油醚（60～90℃）100ml，75℃超声30min，脱脂，离心，挥干溶媒，药渣加蒸馏水400ml，超声提取20min，离心，减压浓缩，浓缩液加乙醇使含醇量达80%，冰箱静置过夜，离心，沉淀先后用乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤，60℃烘干至恒重，即得精制双参多糖[5]。精密称取精制双参多糖100mg，置100ml容量瓶中加蒸馏水溶解并稀释至刻度，从中取1ml于10ml容量瓶中定容至刻度，摇匀，即得0.1mg/ml精制双参多糖溶液，备用。

2.1.2 5%苯酚溶液的配制取苯酚100g,加铝片0.10g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集182℃馏分。称取精制苯酚10g，加水溶解，定容于200ml棕色容量瓶中（临用前配制）。

2.1.3 对照品溶液的配制精密称取葡萄糖对照品100mg，置100ml容量瓶中加水溶解并稀释至刻度，即得1mg/ml对照品储备液。精密取上述储备液1ml于10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀即得0.1mg/ml对照品溶液。

2.1.4 样品溶液的制备样品粉碎，过40目筛，精密称取0.5g，置圆底烧瓶中，加蒸馏水20ml，超声提取两次，每次30min，离心，残渣用水洗涤（5ml×3），合并上清液和洗液于100ml容量瓶中，定容，摇匀。精密移取上述液1ml于25ml容量瓶中，定容，摇匀，即得。

2.2 测量波长的选择

精密吸取浓度为0.1mg/ml对照品溶液、精制双参多糖溶液、蒸馏水各1ml于10ml具塞试管中，再各加5%的苯酚溶液1ml，摇匀，并迅速加入浓硫酸5ml，待冷却后，沸水浴中加热15min，迅速冷却至室温，用分光光度计在200～600nm作全波长扫描，结果两者在488～490nm范围内均有最大吸收，图谱见图1，所以确定最佳吸收波长为488nm。

图1 精制多糖与葡萄糖对照品光谱扫描曲线图

图2 对照品标准曲线图

2.3 换算因素的测定

精密移取0.1mg/ml精制双参多糖溶液1ml，按“2.2.1”依法操作，测定A，用回归方程计算多糖溶液中折合葡萄糖的浓度，利用公式f=W/（C×D）计算换算因素，得f=1.1687（n=3）。式中W为多糖的质量（ug），C为多糖浓度（ug/ml），D为稀释因素。样品测定：精密移取样品溶液1ml，按“2.2.1”项自“加5%的苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定A，用回归方程计算样品溶液中折合葡萄糖的浓度，按下式计算样品中的多糖含量：

多糖含量（%）=C×D×f/W×100（1）

式（1）中,W为供试品的质量（g）,C为供试品液中葡萄糖浓度（ug/ml），D为供试品的稀释因素,f为换算因素。

2.4 标准曲线的绘制

精密吸取浓度为0.1mg/ml的对照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分置10ml具塞试管中，依次加蒸馏水补至2ml，按“2.2.1”依法操作，测定A。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（c）为横坐标，绘制标准曲线（见图2），回归方程为A=0.0075c+0.0197，r=0.999 6。结果表明，葡萄糖在20.0-120.0ug范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取同一供试品溶液1.0ml，按“2.2.1”依法操作，连续测定6次，吸光度值分别为0.448、0.448、0.448、0.447、0.446、0.445，得RSD为0.28%，表明精密度良好。

2.6 稳定性实验精密吸取同一供试品溶液1.0ml，按“2.2.1”依法操作，显色后于488nm处每隔10min测定一次吸光度值，连续测定1.5h，吸光度值分别为0.496、0.503、0.504、0.503、0.502、0.501、0.500、0.500、0.498，得RSD为0.52%，表明样品溶液在1.5h内稳定。

2.7 重现性试验

取同一样品6份，按“2.1.4”项制备供试品溶液，按“2.2.1”依法操作，测定A，求得多糖的含量分别为：34.71%、36.80%、36.39%、36.96%、35.45%、36.45%，RSD为2.41%，结果表明本实验重复性良好。

2.8 加样回收率实验

表3 回收率试验结果（n=9）

精密称取已知含量的样品（多糖含量36.13%）粉末9份，按高、中、低分别按下表精密加入葡萄糖对照品溶液，按“2.1.4”制备供试品溶液，按照“2.2.1”依法操作，测定A，计算回收率，结果见表3。结果表明，本实验确立的方法回收率较好。

2.9 样品测定

取不同采摘地点的双参药材，按“2.1.4”项制备供试品溶液，并按“2.2.1”项自依法操作，测定A，计算样品中多糖的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n=3）

3.讨论

超声技术已经广泛应用于植物有效成分的提取[6],可以大幅度地提高有效成分的提取率，简化提取操作步骤，缩短提取时间，提高工作效率，节省溶剂。在实验过程中，硫酸-苯酚溶液必须现配现用，并放入棕色瓶中避光保存。在测定多糖含量时，保持较高的硫酸浓度非常重要，因为该显色反应是以对多糖的水解和糠醛反应为基础，硫酸浓度低，会影响两种反应的进行，由于样品中苯酚的加入量会影响硫酸的浓度，故必须控制一个合适的比例。双参中多糖的含量较高，达27%-40%，楚雄地区的双参多糖含量明显低于其他两个地区，可能是由于该地区采购的药材为放置多年的陈药所致。本文对双参多糖含量进行了测定，为双参药材质量评价和进一步开发利用提供依据。

[1]杨本雷，余惠祥，等.中国彝族药学[M].昆明：云南民族业版社，2004.198-199.

[2]李耕冬，贺廷超.彝医植物药[M].四川民出版社，1990.117-118.

[3]刘晓波，郭美仙，徐静，等.双参对小鼠抗应激作用的实验研究[J].现代医药卫生，2008，24（9）：1265-1266.

[4]刘晓波,郭美仙,李龙星.双参降血糖作用的研究[J].云南中医中药杂志，2008，29（5）：49-50.

[5]李娜，杨晓杰，李旭业.植物多糖提取技术研究[J].高师理科学刊，2012，32（2）：86-89.

[6]韩勇.超声波法提取茯苓菌丝体胞内多糖的研究[J].黑龙江农业科学,2013,（6）：112-116

王晓芳（1986-），女，汉族，云南楚雄人，本科，助教，研究方向：药理学教育；

梅桢（1985-），女，汉族，云南昆明人，本科，讲师，研究方向：化学与药学教育；

杨艾（1988-），女，汉族，云南宣威人，本科，助教，研究方向：药理学教育。