WAVE3和E-cadherin在结直肠癌中的表达及与肝转移的关系研究

牛瑞龙， 王家宏， 李小刚

论 著

WAVE3和E-cadherin在结直肠癌中的表达及与肝转移的关系研究

牛瑞龙， 王家宏， 李小刚

目的探讨WAVE3和上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)在结直肠癌中的表达及与结直肠癌肝转移的相关性。方法将2008年1月至2013年6月内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院收治的结直肠癌患者，按是否有肝转移分为非肝转移组(48例)和肝转移组(48例)。对照组：48例为上述病例中数字法抽取的癌旁>5 cm的正常黏膜组织。应用免疫组化法检测WAVE3 和E-cadherin在结直肠癌及癌旁组织中的表达，分析两者在结直肠癌中的表达及与肝转移的相关性。结果①WAVE3在结直肠癌不伴肝转移及结直肠癌伴肝转移患者的原发灶组织中的表达阳性率高于癌旁正常黏膜组织(P<0.05)；WAVE3在结直肠癌伴肝转移患者原发灶组织中的表达阳性率低于结直肠癌不伴肝转移的表达(P<0.05)；②E-cadherin在结直肠癌不伴肝转移及结直肠癌伴肝转移的患者的原发灶组织中的表达阳性率低于癌旁正常黏膜组织(P<0.05)；E-cadherin在结直肠癌伴肝转移的表达阳性率低于结直肠癌不伴肝转移的表达(P<0.05)；③Spearman相关分析显示，WAVE3和E-cadherin表达的阳性率无显著相关性(r=-0.199，P>0.05)；④WAVE3的表达均与肿瘤的淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05)，E-cadherin的表达均与肿瘤的分化程度，淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05)。结论WAVE3和E-cadherin在结直肠癌肝转移患者结直肠癌组织中表达降低与结直肠癌侵袭、转移、预后相关，联合检测WAVE3和E-cadherin在结直肠癌中的表达，可能有助于预防结直肠癌肝转移的发生。

结直肠肿瘤； 肝肿瘤； 肿瘤转移； 钙黏着糖蛋白类; 免疫组织化学； WAVE3

在我国结直肠癌的发病率居恶性肿瘤发病率的第4位，而且近年来呈上升趋势。15%～25%的结直肠癌患者在确诊时已有肝转移，另有15%～25%的患者在结直肠癌根治术后发生肝转移[1]。肝转移是结直肠癌患者最主要的死亡原因，因此寻找早期诊断结直肠癌肝转移的方法有着重要意义。结直肠癌肝转移的发展是一个多环节多步骤的过程：癌细胞由运动因子启动，生成细胞伪足，并通过黏附细胞外基质，分泌相关活性酶降解和破坏细胞外基质和基底膜，通过细胞的变形及运动，脱离原发灶，经过一个复杂的驱动过程，进入血管，到达肝脏，穿出血管重新黏附在肝组织，进而新生血管增生，肝转移灶生成。整个转移过程中，细胞的驱动力和细胞间的黏附力至关重要。近年研究发现，WAVE3是一种新型肌动蛋白调节蛋白，它的表达可促进细胞伪足的形成，介导肌动蛋白细胞骨架细胞的重组以增加肿瘤的迁移和侵袭[2-3]。上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)是经典的细胞黏附分子，在肿瘤的侵袭转移中起重要作用，其表达缺失常伴远处转移且预后较差[4]。本研究通过免疫组化检测WAVE3及E-cadherin在结直肠癌组织中的表达情况，分析其与肝转移的关系，探讨两者在结直肠癌肝转移中的预测价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象和标本来源 收集2008年1月至2013年6月包头市肿瘤医院收治的结直肠癌的患者。纳入标准：①行结直肠癌根治术，切缘阴性；②经术后病理学检查诊断为结直肠腺癌，肝转移灶经病理学检查证实来源于结直肠腺癌；③术前均未行新辅助治疗。排除标准：①术前行新辅助治疗；②临床病理资料不完整。共96例入组，其中男55例，女41例，年龄45～72岁，平均年龄(55.82±9.54)岁。30例患者肿瘤位于右半结肠(包括盲肠、升结肠、结肠肝曲及横结肠)，66例患者肿瘤位于左半结肠(包括结肠脾曲、降结肠、乙状结肠及直肠)；42例患者有淋巴结转移，54例无淋巴结转移；73例为高-中分化腺癌；23例为低分化腺癌。本研究通过包头市肿瘤医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 分组情况 按是否伴肝转移分为：非肝转移组48例，患者术前影像学诊断或术中探查无肝转移，术后3年内发现有肝脏转移；肝转移组48例，患者术前影像学诊断、术中探查已有肝转移或术后3年内未发现有肝脏转移；对照组48例，在上述病例中按数字法抽取的癌旁>5 cm的正常黏膜组织。

1.3 主要试剂 WAVE3兔抗人单克隆抗体购于成都正能生物技术有限公司；E-cadherin单克隆抗体，二抗购于福州迈新生物技术公司；Envision二步法免疫组化检测试剂盒购于上海长岛生物公司。

1.4 免疫组化染色方法 免疫组化Envision二步法按试剂盒说明书操作，经高压锅煮沸抗原修复。用PBS代替一抗做阴性对照，用已知相应蛋白阳性切片作阳性对照。

1.5 结果判断 WAVE3染色结果判定：WAVE3在细胞质内出现明确的棕黄色颗粒定义为阳性，分别对染色强度(0分为无染色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色)和阳性细胞百分率(0分为<5%；1分为5%～25%；2分为26%～50%；3分为51%～74%；4分为≥75%)进行计分，两者相乘为免疫组化总分。将免疫组化总分0～3分者计为阴性，4～12分计为阳性，进行数据统计。

E-cadherin染色结果判定：以棕黄色或棕褐色均匀颗粒状物质>30%定义为强阳性表达(++)，5%～30%定义为阳性表达(+)，<5%或胞质和(或)胞膜无着色定义为阴性(-)。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，WAVE3和E-cadherin在各组间的表达率比较采用χ2检验，WAVE3和E-cadherin相关性采用Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测WAVE3和E-cadherin的表达 WAVE3在正常黏膜很少表达(图1)，对照组阳性率仅为12.5%(6/48)；WAVE3在癌组织中表达定位于细胞质，呈棕黄色颗粒分布(图2)。

图1 WAVE3在正常组织中的表达WAVE3在正常组织中几乎不表达，细胞质及细胞膜无明显着色 (Envision ×100)

图2 WAVE3在结肠癌组织中的表达WAVE3在结直肠癌组织中呈强阳性表达，细胞质中大量染色均一的棕黄色颗粒(Envision ×100)

在非肝转移组的原发灶组织中呈均一棕黄色分布，阳性率较高为60.42%(29/48)；在肝转移组的原发灶组织中的表达反而降低，阳性率为37.50%(18/48)。3组总体比较差异有统计学意义(χ2=23.706，P<0.05)，见表1。3组间两两比较，WAVE3在肝转移组中的阳性表达率较对照组高，差异有统计学意义(χ2=8.000，P=0.005)；WAVE3在非肝转移组中的阳性表达率较对照组高，差异有统计学意义(χ2=23.786，P=0.000)；而WAVE3在肝转移组的阳性表达率较非肝转移组低，差异有统计学意义(χ2=5.044，P=0.025)。

E-cadherin在对照组中表达阳性率为89.58%(43/48)，主要位于腺上皮的细胞膜上(图3)；在癌组织中阳性表达较少，主要位于细胞质内(图4)。在非肝转移组的原发灶组织中表达较低，阳性率为47.92%(23/48)；在肝转移组的原发灶组织中的大部分无表达，阳性率为27.08%(13/48)。3组比较差异有统计学意义(χ2=39.260，P=0.000)，见表1。3组间两两比较，E-cadherin在肝转移组中的阳性表达率较对照组低，差异有统计学意义(χ2=38.571，P=0.000)；E-cadherin在非肝转移组中的阳性表达率较对照组低，差异有统计学意义(χ2=19.394，P=0.000)；E-cadherin在肝转移组的阳性表达率较非肝转移组低，差异有统计学意义(χ2=4.444，P=0.035)。

表1 WAVE3和表1E-cadherin在3组间的表达情况[例(%)]

图3 E-cadherin在正常组织中的表达E-cadherin在正常组织中的表达主要位于腺上皮的细胞膜上，呈染色均一的棕黄色颗粒(Envision ×100)

图4 E-cadherin在结直肠癌组织中的表达E-cadherin在结直肠癌组织中的表达主要位于细胞质内，呈染色均一的浅棕色颗粒(Envision ×100)

2.2 WAVE3和E-cadherin在结直肠癌中的表达Spearman相关分析发现WAVE3和E-cadherin表达无相关性(P>0.05)，见表2。

表2 结直肠癌中WAVE3与E-cadherin表达的关系(例)

2.3 WAVE3和E-cadherin表达与结直肠癌临床病理特征的关系 E-cadherin在结直肠癌中的表达与淋巴结转移和Dukes分期相关(P<0.05)；WAVE3在结直肠癌中的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移和Dukes分期相关(P<0.05)，见表3。

表3 WAVE3和E-cadherin的表达与结直肠癌临床病理特征的关系[例(%)]

*差异有统计学意义(P<0.05)

3 讨论

WASP家族是一种新型肌动蛋白调节蛋白，它的缺失使细胞在结构、迁移和侵袭等方面均表现出异常[3]，WAVE3作为其中一个成员在肿瘤细胞的迁移和侵袭中起着重要作用[5]。一些WASP家族的成员可能根据不同的肿瘤类型及不同的肿瘤分期，起到促进肿瘤进展或抑制肿瘤进展的作用[6]。WAVE3调控肿瘤细胞的侵袭和转移是一个涉及多种蛋白及通路的复杂过程。目前的研究表明：在乳腺癌及前列腺癌的患者中WAVE3高表达往往预示预后不好。Sossey-Alaoui等[7]的研究显示，在转移性乳腺癌细胞系中WAVE3呈高水平表达，提示WAVE3表达水平升高可能与乳腺癌的进展相关；其进一步发现，Ⅲ期肿瘤比Ⅰ期肿瘤WAVE3的表达水平大约高出3倍，而在正常的乳腺细胞或Ⅰ期肿瘤中很少或没有检测到WAVE3的表达。Moazzam等[8]发现，敲除了WAVE3基因的PC-3前列腺癌细胞侵袭及转移能力下降，但细胞的增殖速度未受影响；同时他们还证明，敲除了WAVE3基因而导致的细胞侵袭转移能力下降可能与MMP-2的减少有关。以上结果表明，WAVE3的表达在乳腺癌和前列腺癌的进展和转移中起着重要的作用。本文结果显示，WAVE3在正常结直肠癌黏膜组织表达缺失(12.5%，6/48)，而在结直肠癌不伴肝转移(60.42%，29/48)及结直肠癌伴肝转移组中(37.50%，18/48)表达相对较高，且两两之间存在统计学差异。WAVE3在结直肠癌中的表达阳性率与性别，年龄，肿瘤大小，肿瘤位置，分化程度无关，而与结直肠癌的是否有淋巴转移，Dukes分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。WAVE3蛋白在结直肠癌中高表达，但在结直肠癌肝转移组中WAVE3的阳性表达率较结直肠癌不伴肝转移组低，提示WAVE3低表达的结直肠癌患者往往出现肝转移。Zhang等[9]研究发现，WAVE3高表达的结直肠癌患者往往没有淋巴结的转移及远处转移，病理分期较好，预后也较好。我们的结果与之相似。WAVE3在结直肠癌肝转移组低表达究其原因可能与WAVE3介导细胞侵袭转移的信号通路p38MAPK有关[10]。Grossi等[11]提出：p38MAPK通路在涉及癌症的相关过程中(如细胞的代谢，浸润，炎症和血管生成方面)起到致癌作用。

E-cadherin是介导细胞与细胞间互相黏附作用的跨膜糖蛋白，在生理条件下，调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的黏附反应，维持组织结构形态和完整性，一旦E-cadherin表达下降甚至缺失，细胞间黏附力下降，肿瘤细胞失去接触抑制作用，促进肿瘤浸润、转移[12-13]。E-cadherin是上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的重要标志物之一[14]，EMT是指上皮细胞失去极性，细胞骨架重塑，转变成具有侵袭转移能力的间质样上皮的现象[15]。近年大量研究证实，EMT存在于上皮性肿瘤侵袭转移过程。结直肠癌进展过程中，细胞间黏附能力减弱，迁移、侵袭能力增强，促使不具侵袭力或者非转移性的上皮性肿瘤获得侵袭性并最终向远处转移。在本实验中，我们发现E-cadherin在结直肠癌中低表达，且结直肠癌肝转移组中表达率更低，说明E-cadherin表达程度越低，结直肠癌的恶性程度越高。E-cadherin在结直肠癌中的表达阳性率与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置无关，而与结直肠癌的分化程度、是否有淋巴转移、Dukes分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。这与刘娟等[16]的研究结果相符合。以上研究结果说明，E-cadherin蛋白表达异常赋予了癌细胞比较强的侵袭转移潜能，参与了结直肠癌肝转移的过程。同时我们对WAVE3和E-cadherin在结直肠癌组织中的表达情况进行相关分析，结果显示，WAVE3和E-cadherin表达之间无明显相关，暂未发现存在相互调节的关系。

本研究结果提示：WAVE3和E-cadherin在结直肠癌肝转移患者结直肠癌组织中表达降低与结直肠癌侵袭、转移、预后密切相关。联合检测WAVE3和E-cadherin在结直肠癌中的表达，可能有助于检测及预防结直肠癌肝转移的发生。

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ExpressionofWAVE3andE-cadherinincolorectalcarcinomaanditsrelationshipwithlivermetastasis

NIURuilong1,WANGJiahong2,LIXiaogang2.

(1.GraduateSchool,BaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;2.TheDepartmentofGeneralSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014016,China)

WANGJiahong,Email:522653092@qq.com

ObjectiveTo detect the expression of WAVE3 and E-cadherin in colorectal carcinoma (CRC) and to investigate its correlation with colorectal carcinoma liver metastasis (CRLM).MethodsA total of 48 CRC cases and 48 CRLM cases were selected randomly as research objects. Adjacent normal laryngeal mucosa (>5 cm) of 48 cases from the patients above were randomly selected as the control group. The expressions of WAVE3 and E-cadherin in resection specimens of colorectal cancer tissues and adjacent tissues were assayed by immunohistochemistry staining method. Correlations between of the expressions with liver metastasis were also analyzed.Results①The positive expression rates of WAVE3 protein in CRC and CRLM were significantly higher than that in adjacent normal mucosa tissues (bothP<0.05). The expression of WAVE3 in CRLM was significantly lower than that of CRC (P<0.05). ②The positive expression rates of E-cadherin protein in CRC and CRLM were significantly lower than that in adjacent normal mucosa tissues (bothP<0.05). The expression of E-cadherin in CRLM was significantly lower than that of CRC (P<0.05). ③The positive expression rates of WAVE3 and E-cadherin had no significant correlation in Spearman relative analysis(r=-0.199,P>0.05). ④The expression of WAVE3 was associated with lymph node metastasis and Dukes stage (bothP<0.05). The expression of E-cadherin protein was correlated with the tumor differentiation degree, lymph node metastasis and Dukes staging (allP<0.05).ConclusionsSynchronously low expressions of WAVE3 and E-cadherin in colorectal carcinoma were associated with liver metastasis, which provide a new method for early prevention or early diagnosis of CRLM.

Colorectal neoplasms; Liver neoplasms; Neoplasm metastasis; Cadherins; Immunohistochemistry; WAVE3

014040 内蒙古 包头，内蒙古科技大学包头医学院 研究生院(牛瑞龙)； 014016 内蒙古 包头，内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院 普外二科(王家宏，李小刚)

王家宏， Email:522653092@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.03.007

1674-4136(2017)03-0162-05

2016-11-27][本文编辑：李庆]