凋亡抑制基因Livin在喉鳞状细胞癌中的表达及与预后的关系*

马 鹏，冯 俊,彭 涛

南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院 耳鼻咽喉头颈外科 (南充 637000)

·论著·

凋亡抑制基因Livin在喉鳞状细胞癌中的表达及与预后的关系*

马 鹏，冯 俊△,彭 涛

南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院 耳鼻咽喉头颈外科 (南充 637000)

目的分析Livin基因在喉鳞状细胞癌组织中的表达情况，并探究其在喉鳞状细胞癌发生、发展及预后中的作用及机制，为喉鳞癌的临床诊断、治疗以及病情预测提供可参考依据。方法选取2013年3月至2016年10月南充市中心医院耳鼻咽喉头颈外科经手术切除的34例喉鳞癌组织、19例癌旁组织和15例正常喉黏膜组织，分别应用SP免疫组化法检查Livin的表达情况，并结合患者的病理结果和随访资料，探究Livin表达与各临床特点以及预后的关系。结果Livin在喉鳞癌组织中的高表达率为70.59%，在癌旁组织中的高表达率15.79%，在正常喉黏膜组织中无Livin高表达，差异有统计学意义(P<0.05)；在喉鳞癌中，Livin高低表达与临床分期、淋巴结是否转移、病理分级以及病程差异有统计学意义(P<0.05)，但与患者年龄、性别、肿瘤病灶大小和临床分型差异无统计学意义(P>0.05)；经Cox 回归性分析发现，Livin阳性表达、病程长、淋巴结转移、病理分级和癌症晚期是影响喉鳞癌患者生存率的独立危险因素。结论Livin基因的阳性表达在喉鳞癌的发生、发展及预后中发挥着重要作用，可将其作为判断喉鳞癌病情进展及预后的主要指标之一。

喉鳞状细胞癌；凋亡抑制基因；Livin；免疫组化法；预后

喉鳞状细胞癌是临床较为多见的一种头颈部恶性肿瘤，近年来，随着人们生活习惯改变或环境污染加重，其发生率呈逐年增长趋势，极易影响患者的生活质量并危害其生命。因此，探讨分析喉鳞状细胞癌的发生、发展机制及其预后成为了临床工作者研究的课题之一。相关研究[1]报道，目前对于喉鳞癌的发生机制尚无明确说法，但癌症发生的重要原因为体内肿瘤细胞凋亡被抑制，而正常组织细胞的凋亡、增殖功能失调。Livin是近年新发现的一种凋亡抑制基因，多在癌变组织中呈高表达，且能够发挥极强的抗凋亡作用[2]。本研究主要探究Livin在喉鳞癌组织、癌旁组织及正常组织中表达情况，并观察其与喉鳞癌发生、发展和预后的关系，为喉鳞癌的临床诊断、治疗、病情预测提供可参考依据。

1 资料与方法

1.1临床资料

选取2013年3月至2016年10月南充市中心医院耳鼻咽喉头颈外科经手术切除的原发喉鳞癌组织标本34例，另取距离癌灶边缘<0.5 cm的癌旁组织标本19例和距离癌灶边缘>2.0 cm的正常喉黏膜组织15例。所有患者均为首次进行手术，术前未曾接受放化疗等其他治疗方式，愿意配合研究，签订知情同意书，且其临床资料齐全。术后经病理活检证实癌旁组织和正常喉黏膜组织为正常黏膜或炎症状态，而原发喉鳞癌组织明确为鳞状细胞癌。34例原发喉鳞癌患者中，男32例，女2例；年龄30～72(58.23±2.55)岁；病程1～10(5.04±1.36)年；临床分期：4例为Ⅰ期，9例为Ⅱ期，11例为Ⅲ期，10例为Ⅳ期；喉癌分型：12例声门型，20例声门上、下型，2例跨声门型；16例患者无淋巴结转移，18例伴淋巴结转移。上述标本均在解剖后1 h内收集完毕，并用10%福尔马林妥善固定，石蜡包埋，连续4张切片(厚4 μm)，备用。

1.2试剂

Livin兔抗人多克隆抗体(美国Imgenex公司)，SP免疫组化试剂盒(购于上海研卉公司)。

1.3方法

操作步骤严格按照SP免疫组化试剂盒说明书进行。具体操作如下：1)脱腊：将切片常温放置60 min，随后将其经二甲苯 Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡10 min；2)脱水：在室温条件下，用3%双氧水浸湿切片并静置10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；3)抗原修复：先用PBS缓冲液冲洗切片3次，然后放置在微波炉内，以中档微波处理10 min；4)血清封闭：用正常山羊血清封闭，室温下静置10 min，并吸取多余液体；5)滴加一抗：滴加适量浓度为1∶200的 Livin抗体，室温放置1 h； 6)滴加二抗：滴加适量生物素标记的二抗，室温静置30 min；7)滴加三抗：滴加1滴辣根过氧化氢酶标记的三抗，室温静置30 min；8)显色和复染：用PBS缓冲液冲洗切片3次，用DAB显色液显色后，再用自来水冲洗10 min，然后利用苏木素复染2 min；9)封片：用梯度酒精脱水后，再用二甲苯透明，就可以用中性树胶滴在组织附近以封片，进行镜检；10)质量控制标准：阳性对照：已知的Livin表达阳性喉鳞癌切片；阴性对照：利用PBS缓冲液来取代一抗溶液。

1.4结果判断标准

每张切片在BX43-12P02显微镜(奥林巴斯)下，随机选取5个高倍镜视野，每视野计数≥100个细胞。 Livin主要在细胞质中表达，若切片经苏木素复染后，在显微镜下见胞质呈棕黄色则为Livin阳性细胞[3]。Livin阳性表达主要根据细胞染色深浅程度和Livin阳性细胞百分比来综合判断。1)染色程度：若染色为深褐色则3分，棕黄色则2分，淡黄色则为1分，未染色的为0分；2)Livin阳性细胞>75%为4分，51%～75%为3分，26%～50%为2分，6%～25%为1分，<6%为0分。若1)×2)得分在9～12分则为强阳性(+++)，4～8分则为阳性(++)，1～3分则为弱阳性(+)，0分则为阴性(-)。其中，将强阳性、阳性患者纳入Livin高表达，而弱阳性、阴性者则为Livin低表达[4]。

1.5统计学方法

研究数据分析使用SPSS 18.0软件包，定性资料采用例数(%)描述，经2检验或Fisher精确检验；另外，运用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，而多因素分析则使用Cox回归模型。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1Livin在喉鳞癌组织、癌旁组织和正常喉黏膜组织中的表达率比较

经免疫组化实验发现，Livin主要在细胞质或细胞核上着色，呈棕黄色颗粒状(图1)。此外，Livin在喉鳞癌组织中的高表达率为70.59%，明显高于癌旁组织(15.79%)和正常喉黏膜组织(0.00%)(P<0.05)(表1和图2)。

图1 喉鳞癌组织、癌旁组织和正常喉黏膜组织的切片免疫组化(×250) 注：A. Livin蛋白在喉鳞癌组织中的表达；B. Livin蛋白在喉癌旁组织中的表达；C. Livin蛋白在正常喉黏膜组织中的表达

表1Livin在喉鳞癌组织、癌旁组织和正常喉黏膜组织中的表达率比较

样本样本数Livin低表达高表达高表达率[n(%)]喉鳞癌组织34102424(70.59)癌旁组织191633(15.79)正常喉黏膜组织151500(0.00)Fisher精确概率25.508P<0.001

图2Livin在喉鳞癌组织、癌旁组织和正常喉黏膜组织中的表达率比较

2.2Livin在喉鳞癌组织中的表达和与各项临床特点的关系

在喉鳞癌组织中，Livin高表达与临床分期、淋巴结转移、病理分级以及病程差异有统计学意义(P<0.05)，但与患者年龄、性别、肿瘤病灶大小和临床分型差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

2.3喉鳞癌组织中Livin表达与生存率的关系

2.3.1 单因素分析 将可能影响喉鳞癌患者生存率的9个危险因素应用Kaplan-Meier法进行单因素分析，结果发现，病程、临床分期、淋巴结转移、病理分级和Livin表达对患者生存率具有明显的影响(P<0.05)(表3和图3)。

表2Livin在喉鳞状细胞癌组织中的表达和与各项临床特点的关系

临床特点样本数Livin低表达高表达高表达率/%x2P性别 男3292371.880.4340.510 女21150.00年龄/岁 ≥601541173.330.0970.755 <601961368.42病程 >6个月2222090.9112.398<0.001 ≤6个月128433.33肿瘤病灶大小/cm >31851372.220.0490.824 ≤31651168.75临床分型 声门型124866.670.6850.710 声门上、下型2051575.00 跨声门型21150.00临床分期 Ⅰ～Ⅱ期127541.677.4720.006 Ⅲ～Ⅳ期2231986.36病理分级 低分化1411392.867.8520.020 中分化1661062.50 高分化43125.00淋巴结转移 有1811794.4410.4850.001 无169743.75

表3 影响喉鳞癌患者生存率的单因素分析

2.3.2 多因素分析 将性别、年龄、病程、肿瘤病灶大小、临床分型、临床分期、病理分级、淋巴结转移和Livin表达设置为自变量进行Cox多因素回归性分析，结果发现，Livin高表达、病程长、病理分级、淋巴结转移和癌症晚期是影响喉鳞状细胞癌患者生存率的独立危险因素(P<0.05)(表4)。

表4 影响喉鳞癌患者生存率的多因素分析

图3 Livin高表达和低表达患者的生存率曲线图

3 讨论

喉鳞状细胞癌是一种由喉部鳞状上皮黏膜组织发生病变所导致的癌症，其发病率约占全身恶性肿瘤的2.5%，占头颈部癌症的10%～30%[5]。患者多表现为声嘶、咽喉部及耳部疼痛、咳嗽、血痰、颈部可触及包块，甚者还可出现呼吸困难等，影响患者正常生活和工作，并危及其生命。因此，积极寻找合理、有效的治疗方案对改善本病患者预后、延长其生存期具有至关重要的临床意义。然而，目前在临床上对于喉鳞癌的具体发病原因仍不十分明确，为临床治疗增加了难度，但也有大量研究[6]证实，细胞凋亡过程紊乱是喉鳞癌发生、发展的主要机制之一。因此，如何促进喉鳞癌细胞凋亡、阻止癌症细胞增殖，引起了临床工作者关注。

Livin为凋亡抑制蛋白家族中一员，具有极强的细胞凋亡抑制作用，不但能影响细胞凋亡周期，还可以参与细胞凋亡信号通路的转导。Nedelcu等[7]研究发现，Livin在癌症组织中的表达率明显高于正常组织，且存在于多种恶性肿瘤细胞中，如黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、卵巢癌等。本研究结果也发现，Livin在喉鳞癌组织中的高表达率为70.59%，明显高于癌旁组织(15.79%)和正常喉黏膜组织(0.00%)，与赵厚育等[8]的研究结果基本吻合，其研究结果报道，Livin在喉癌组织中的表达率61.50%，而在正常组织中呈阴性表达，说明Livin的表达可能与喉鳞癌的发生、发展有紧密关系。

相关研究[9]报道，喉鳞癌的发生主要与细胞增殖和凋亡的动态平衡失调有关，而Livin在癌组织中的高表达可进一步抑制细胞凋亡，导致细胞增殖、凋亡的距离增大，更有利于癌症细胞繁殖，使肿瘤发生浸润、远处转移等。黄方名等[10]研究发现，Livin基因在喉原发鳞状细胞癌中高表达(72.58%)，且其表达率可随癌症的临床分期、淋巴结转移、组织学分级的升高而升高。本研究也显示，在喉鳞状细胞癌组织中，Livin表达高低与临床分期、有无淋巴结转移、病理分级以及病程长短差异有统计学意义(P<0.05)，而与患者年龄、性别、肿瘤病灶大小、临床分型差异无统计学意义(P>0.05)，因此，推测Livin表达率升高有可能是喉鳞癌病情进一步恶化的标志之一。

陈亮等[11]通过进行免疫组织化学法检测90例乳腺癌患者中Livin表达对其预后的影响，发现Livin阳性表达患者其3、5、10年生存率都明显低于Livin低表达病患，提示Livin表达可能会影响患者预后。本研究为进一步探究影响喉癌患者预后的因素，对有可能影响喉癌患者生存率的9个危险因素进行单因素分析，结果显示，病程、临床分期、淋巴结转移、病理分级和Livin表达对患者生存率具有明显影响(P<0.05)，而患者性别、年龄、肿瘤病灶大小、临床分型与其生存率无明显相关性。然而，在临床研究中可知道，影响喉鳞癌患者生存率的因素是多方面相互作用的，如果只是从某1个因素进行论述研究，其结果缺乏科学性、真实性。Cox回归模型是多因素生存分析方法，可以对各项影响因素进行筛查、综合分析，有效避免混杂因素对研究结果的影响[12]。本研究利用Cox回归模型进行多因素分析，结果发现，Livin高表达、病程长、病理分级、淋巴结转移和癌症晚期是影响喉鳞癌患者生存率的独立危险因素。

综上所述，Livin基因表达在喉鳞癌的发生、发展及预后中发挥着重要作用，可将其作为判断喉鳞癌病情进展及预后的主要指标之一。

[1]孟凡生, 高珊, 徐勤, 等. Caspase-3蛋白在喉鳞癌组织中表达及与喉癌细胞凋亡的对比研究[J]. 临床和实验医学杂志, 2013, 12(4): 258-260.

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[4]姚文娟, 陈素萍, 宋会双, 等. Livin 基因在结直肠癌中的表达及其与 PTEN 和Caspase-3的相关性研究[J]. 大连医科大学学报, 2014, 36(3): 221-224.

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[8]赵厚育, 任婕, 卓贤露, 等. 凋亡抑制因子Livin蛋白在喉癌组织中的表达及与预后的关系[J]. 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志, 2012, 18(4): 253-257.

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[11] 陈亮, 艾宁, 戴殿禄, 等. 凋亡抑制因子Livin在乳腺癌中的蛋白表达及与预后的关系[J]. 中国现代医学杂志, 2012, 22(17): 49-53.

[12] 周学军, 王晓凤, 冯勇军, 等. 63例喉癌患者预后影响因素分析[J]. 实用医学杂志, 2015, 31(19): 3208-3210.

TheExpressionofLivininLaryngealSquamousCellCarcinomaandItsCorrelationwithPrognosis

MaPeng,FengJun△,PengTao.

DepartmentofOtorhinolaryngology-HeadandNeckSurgery,NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalMedicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China

ObjectiveTo analyze the expression of Livin gene in the tissues of laryngeal squamous carcinoma, investigate the role and mechanism of Livin gene in the occurrence, development and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma, and provide a reference for the clinical diagnosis and treatment and the disease prediction.MethodsThe tissues insected from34cases of laryngeal carcinoma tissues,19cases of paracancerous tissues and15cases of normal laryngeal mucosa tissues from March of2013to October of2016in Nanchong Central Hospital were selected and examined by the SP immunohistochemical method to detect the expression level of Livin. The pathological results and follow-up data were analyzed to investigate the correlation of the Livin expression level with the clinical features and prognosis respectively.ResultsThe high expression rate of Livin in the tissues of laryngeal squamous cell carcinoma and the paracancerous tissues were70.59% and15.79% respectively and there was no high expression of Livin in the normal laryngeal mucosa tissues. There were significant differences between the three groups (P<0.05). In laryngeal squamous cell carcinoma, the expression level of Livin was correlated with clinical stage, lymph node metastasis, pathological grading and disease course (P<0.05), while it was not correlated with age, gender, tumor size and clinical type (P>0.05). The results of Cox regression analysis showed that the positive expression of Livin, long disease course, lymph node metastasis, pathological grading and advanced cancer were independent risk factors of the survival rate of the patients with laryngeal squamous cell carcinoma.ConclusionThe positive expression of Livin gene plays an important role in the occurrence, development and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma. It can be used as one of the main indexes to evaluate the progress and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma.

Laryngeal squamous cell carcinoma; Apoptosis inhibitory gene; Livin; Immunohistochemical method; Prognosis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170721.1016.014.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.015

川北医学院博士科研启动项目(No:CBY-QD-08)；南充市科学技术和知识产权局项目(No:16YFZJ0021)

：冯俊，E-mail:flj20041201@163.com

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