干扰素-γ基因多态性与扩张型心肌病相关性研究

周莉，陈海燕，孔山，成家茂

（1.大理大学第一附属医院儿科，云南大理671000；2.大理大学第一附属医院超声科，云南大理671000；3.大理大学第一附属医院检验科，云南大理671000；4.大理大学基础医学院，云南大理671000）

干扰素-γ基因多态性与扩张型心肌病相关性研究

周莉1，陈海燕2，孔山3，成家茂4*

（1.大理大学第一附属医院儿科，云南大理671000；2.大理大学第一附属医院超声科，云南大理671000；3.大理大学第一附属医院检验科，云南大理671000；4.大理大学基础医学院，云南大理671000）

目的：探讨干扰素基因874位点（IFN-γ+874T∕A）的单核苷酸多态性与扩张型心肌病（DCM）易感性之间的关系。方法：收集经大理大学第一附属医院确诊的113例DCM患者（患者组）以及100例汉族健康成人（对照组）的静脉血，采用PCRSSP技术和琼脂糖凝胶电泳检测DCM患者和健康对照者的IFN-γ+874T∕A单核苷酸多态性。结果：患病组IFN-γ+874TT基因型分布频率（30.97%）与健康对照组（8.00%）比较，差异具有统计学意义（χ2=17.631，P＜0.01）；患病组和对照组的T等位基因分布频率分别为40.27%和22.00%，二者比较差异有统计学意义（χ2=16.352，P＜0.001）。结论：IFN-γ+874T∕A多态性与DCM易感性可能存在密切联系。

扩张型心肌病；干扰素-γ；基因多态性

应用免疫抑制治疗扩张型心肌病（Dilated Car⁃diomyopathy，DCM），尤其是近年来被发现的炎症性扩张型心肌病，可显著改善病情〔1〕，表明DCM的发病与病毒感染和自身免疫异常密切相关。干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）是唯一的Ⅱ型IFN，也称为免疫干扰素，除具有广谱抗病毒作用外，对免疫系统也起着关键的调节作用〔2〕。IFN-γ是IFN-γ基因的表达产物，该基因内含子1的+874T∕A位点具有单核苷酸多态性，是产物的高表达表型，与DCM的易感性、病情严重程度和预后相关〔3〕。我们对大理大学第一附属医院确诊的113例DCM患者和100例健康对照者的IFN-γ+874A∕T基因多态性进行了检测，旨在进一步探讨IFN-γ+874T∕A基因多态性与DCM易感性之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集大理大学第一附属医院各科室中自2012年1月至2015年12月经确诊的DCM病人共计113例纳入患病组，均符合中华医学会心血管病学分会2007年颁布的《心肌病诊断与治疗建议》中DCM的诊断标准〔4〕：①左心室舒张期末内径（LVEDD）＞5.0 cm（女性）和＞5.5 cm（男性）。②左心室射血分数（LVEF）＜45%或左心室缩短速率（FS）＜25%。并排除高血压、冠心病、心脏瓣膜病、先天性心脏病、酒精性心肌病、心动过速性心肌病、心包疾病、系统性疾病、肺心病和神经肌肉性疾病等。其中，男68例，女45例，年龄17～82岁，平均（36.45±17.33）岁，汉族，无近亲血缘关系和家族史。另随机选取我院某次健康体检中无近亲血缘关系的成人100例作为正常对照组，其中，男57例，女43例，年龄19～67岁，平均（35.77±19.63）岁。所有研究对象在检验室采血5 mL，从中取2 mL抽检血液作为本次研究所用，所有血液均已经过抗凝处理。

1.2 总DNA提取全血基因组DNA抽提试剂盒购于上海生工，按试剂盒说明进行操作。所有DNA样本-20℃保存。DNA提取、PCR基因转录均在解剖教研室的细胞生物学实验室严格按照无菌要求和检测步骤完成。

1.3 引物设计与合成参照文献〔5〕设计IFN-γ+ 874T∕A位点的PCR引物，所有引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成。见表1。

表1 IFN-γ+874T∕A位点单核苷酸多态性检测的引物序列

1.4 PCR-SSP反应试剂购自大连宝生物工程有限公司，应用美国赛默飞世尔Piko系列PCR仪进行基因扩增。PCR反应体系为25 μL，基因组DNA 2 μL（50～100 ng）、10×PCR缓冲液1.5 μL、dNTPs 200 μmol∕L、引物P1、P2、P3各1.5 μmol∕L，P4、P5各0.5 μmol∕L，Taq DNA聚合酶1.5 U。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s、60℃退火40 s、72℃延伸40 s共30个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物经含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳，稳压140 V，电泳时间15～20 min，在紫外光下观察扩增结果并记录拍照。

1.5 统计学分析使用SPSS 19.0软件进行基因型和等位基因频率，然后经Hardy-Weiberg遗传平衡定律检验，型别分布使用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-γ+874T∕A位点PCR-SSP多态性检测的基因型样本的基因组DNA片段经扩增后，可出现3种不同的基因型阳性条带，分别为TT正常纯合子（264 bp）、AA突变纯合子（264 bp）以及AT杂合子。见表2、图1。

表2 IFN-γ+874T∕A位点多态性检测的基因型

2.2 IFN-γ+874T∕A等位基因的分布频率患病组和对照组人群的IFN-γ+874T∕A位点基因型和等位基因频率，均经Hardy-Weiberg遗传平衡定律检验，达到遗传平衡，具有群体代表性。结果显示，患病组IFN-γ+874TT基因型分布频率（30.97%）较健康对照组（8.00%）显著升高，差异有统计学意义（χ2=17.631，P＜0.001）；且患病组的T等位基因分布频率（40.27%）也较对照组（22.00%）的明显升高，二者比较差异有统计学意义（χ2=16.352，P＜0.001）。见表3。

图1 IFN-γ+874T∕A位点基因型的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

表3 IFN-γ+874位点基因型及等位基因的数量与分布频率

3 讨论

IFN-γ为Ⅱ型干扰素，是Th1细胞产生的免疫因子，与免疫应答机制的启动和调节关系密切。IFN-γ基因位于染色体12q24.1，包含有4个外显子和3个内含子。近年来文献报道的IFN-γ单核苷酸多态性位点有：-183G∕T，+764C∕G，+874A∕T，+2 109A∕G，+2 118A∕G，+2 326T∕C，+2 459A∕G，+2 671T∕C，+3 177T∕G，+3 273G∕A，+3 810G∕A，+5 199A∕T，+5 272A∕G，+4 766C∕T，+5 644G∕A等〔6〕，在内含子区的+874和+2 109位点存在两个调控基因转录的多态性。IFN-γ基因启动上游+874T∕A位点的多态性变异，是由第874位点碱基A变为T所致，可通过改变转录因子的结合位点，影响IFN-γ的表达量〔7〕，且TT为高表达基因型，AA为低表达型基因型，TA为中等表达基因型〔8〕。研究表明，IFN-γ+874T∕A等位基因可能是DCM的遗传易感基因之一〔9〕，这可能与DCM发病机制中的自身免疫调节以及疾病发展过程中Th1细胞针对心肌抗原所产生的免疫反应密切相关〔10〕。研究认为，IFN-γ作为重要的细胞因子，在扩张型心肌病病程发展中发挥着重要的调节作用：促进Th0细胞向Th1细胞分化，通过抑制白细胞介素-4的产生，阻滞Th2的增殖分化，调整Th1∕Th2比例，从而抑制体液免疫，调节自身免疫；通过诱导抗病毒蛋白直接抑制病毒复制；活化NK细胞，形成IFN-NK系统，抵御病毒感染；诱导一氧化氮产生，而发挥抗病毒、扩张血管保护心肌作用〔11〕。本研究结果显示，在海拔超过2 000 m的高原地区汉族人群中，DCM患者的IFN-γ+874TT基因型和T等位基因的表达较正常对照组明显升高，说明IFN-γ+874T∕A基因位点多态性与DCM相关，可能是DCM的易感性基因之一。近年来，随着分子心脏病学研究的进展，应用分子生物学手段治疗DCM已成为该领域的热门话题。因此，今后对于DCM患者而言，介于注射用重组人IFN-γ制剂克隆伽玛不失为一种新的治疗选择，有必要对此类患者的外周血IFN-γ水平及其免疫性指标进行检测，进一步明确IFN-γ对DCM患者自身免疫和心功能的影响。

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Associations of IFN-γ Gene Polymorphism with Dilated Cardiomyopathy

Zhou Li1,Chen Haiyan2,Kong Shan3,Cheng Jiamao4*
（1.Department of Pediatrics,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Ultrasonic Department, The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；3.Department of Laboratory,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；4.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To investigate the relationship between mononucleotide's polymorphism of IFN-γ gene's 874 site and the susceptibility to dilated cardiomyopathy.Methods：In this case-control study,we have collected venous blood of 113 patients with DCM（patients group）and of 100 healthy Han adults（control group）from the first affiliated hospital of Dali University.PCR-SSP technology and agarose gel electrophoresis were applied to detect mononucleotide's IFN-γ+874T∕A polymorphism of the two groups.Results：There were significant differences between the patient group whose IFN-γ+874TT genotypic frequency distribution was 30.97%and the health control group with 8.00%（χ2=17.631，P＜0.001）.The distributive frequencies of T allele in the patient group and control group were 40.27%and 22.00%respectively.There were statistically significant differences between them（χ2=16.352，P＜0.001）.Conclusion：There may be a close relationship between IFN-γ+874A∕T polymorphism and the susceptibility to DCM.

dilated cardiomyopathy;IFN-γ;gene polymorphism

R542.2

B

2096-2266（2017）08-0028-03

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.007

（责任编辑 董杰）

大理大学青年教师科研基金资助项目（KYQN201118）

2016-03-24

2017-03-26

周莉，讲师，主要从事心血管病研究.

*通信作者：成家茂，教授.