ABR反应器处理苯胺黑药废水及其微生物种群结构

杨梓亨, 宋卫锋, 程亚杰, 李海宇, 简静仪

广东工业大学环境科学与工程学院, 广东 广州 510006

ABR反应器处理苯胺黑药废水及其微生物种群结构

杨梓亨, 宋卫锋*, 程亚杰, 李海宇, 简静仪

广东工业大学环境科学与工程学院, 广东 广州 510006

苯胺黑药广泛用作铅锌硫化矿浮选捕收剂，是一种难生化降解浮选药剂. 为考察苯胺黑药的厌氧降解行为，采用ABR(厌氧序批式折流板反应器)对苯胺黑药进行处理，利用扫描电镜研究不同隔室中颗粒污泥的性状，并采用Miseq高通量测序的方法分析起主要作用的隔室中的微生物群落组成. 结果表明，在进水ρ(苯胺黑药)和ρ(CODCr)有一定波动情况下，苯胺黑药和CODCr去除率在各阶段均呈增加趋势. 100 d成功启动后运行稳定；HRT(水力停留时间)为24 h时，苯胺黑药和CODCr去除率分别为67%～71%和68%～73%. 反应器内出现大量颗粒污泥，沿水流方向颗粒污泥粒径分布逐渐减小，颗粒污泥规则、密实，不会流失. Miseq高通量测序结果表明，反应器第1格和第2格中绿弯菌门菌群所占比例(分别为24.73%和33.60%)最大，其次是厚壁菌门(分别为24.17%和20.92%)和变形菌门(分别为18.93%和20.88%)；在属的水平检测到Caldisericum、Leptolinea、Leuconostoc和Bacillus等，使得反应器具有较好的耐冲击负荷和良好的降解作用. 研究表明，ABR对苯胺黑药有良好的去除作用.

ABR反应器； 苯胺黑药； 颗粒污泥； Miseq高通量测序

ABR(厌氧序批式折流板反应器)是一种高效厌氧处理工艺，在工业废水处理领域应用前景广阔. 该工艺使用一系列垂直放置的折流板使反应器分隔成多个连续的隔室，水流速度较慢，通过折流板的阻挡及污泥自身的沉降作用，使活性污泥颗粒被有效地截流在反应器内，从而明显提高了反应器的处理效率[1- 2]. ABR有利于产酸段和产甲烷段在不同的隔室内进行，减缓了高负荷条件下低pH对甲烷菌的抑制作用，在不同隔室形成性能稳定的微生物群落，使反应器具有抗冲击负荷的能力[3]. ABR较好地实现了SMPA(分相多阶段)的工艺思想，具有优异的去除有机污染物的能力. 目前对ABR中微生物种群的研究主要集中在不同种类的甲烷菌上，而对酸化过程中起关键作用的其他种类的微生物在不同格室中的分布情况则研究较少.

苯胺黑药(二苯胺基二硫代磷酸盐)被广泛用作铅锌硫化矿浮选过程的捕收剂，是选矿废水中的主要污染物. 作为矿区水体环境优先控制污染物，苯胺类化合物对生物具有一定的毒性，是一种难生化降解浮选药剂，直接外排对自然环境有很大危害，在工业排水中被严格控制[4- 6]. 目前对苯胺黑药的降解研究主要集中在物理化学法(如混凝法、酸碱中和法、化学氧化法、电化学催化法[7- 9])，对其厌氧降解研究甚少，只是初步研究其厌氧降解的机理，并未深入. 相较于好氧生物处理，厌氧生物法由于能耗低和产泥少等特点得到了广泛应用，应用ABR处理苯胺黑药废水有现实必要性.

该研究采用由4个隔室串联组成的容量为17.5 L 的厌氧折流板反应器处理苯胺黑药废水，着重考察了ABR工艺处理废水中苯胺黑药的效果，研究了不同隔室中颗粒污泥的性状，分析了起主要作用的隔室的微生物群落组成，得到苯胺黑药的厌氧降解的最佳条件，以期为有色金属金属选矿废水的处理提供新的方法和途径.

1 材料与方法

1.1试验装置

注：1—调节池；2—水泵；3—沼气收集管；4—ABR；5—沉淀池；6—排水阀.图1 ABR试验装置示意Fig.1 Schematic diagram of the ABR experimental equipment

试验装置如图1所示，反应器由有机玻璃制成，有效容积17.5 L，由4个隔室组成，上下流室宽度比为5∶1. 沉淀池有效容积为1.55 L，上清液外排. 在反应器启动初期投加活性炭促进颗粒污泥的形成[10].1.2试验用水和运行方案

试验用水为人工配制的模拟废水，ρ(CODCr)及ρ(苯胺黑药)的选取以实际矿山企业长期循环使用的选矿废水水质为依据.ρ(CODCr)在450～600 mg/L之间，苯胺作捕收剂时，累积浓度约为200～300 mg/L.ρ(苯胺黑药)从25 mg/L分阶段逐步增至250 mg/L，按进水ρ(CODCr)的要求增减葡萄糖的添加量. 加入NH4Cl 和KH2PO4调节CODCr∶N∶P(质量比)为200∶5∶1，最后按1 mL/L的量添加微生物生长所需的Ca、Mg、Fe、Co、Ni、Zn、B等微量元素，以保证微生物细胞合成的需要. 此外，配水时投加一定量的NaHCO3保证反应器内的缓冲能力.

ABR反应器接种污泥取自广州沥滘污水厂的厌氧池，启动初期投加粒径为0.2～0.4 mm的活性炭促进颗粒污泥的形成，投加量为3 g/L. 待反应器出水苯胺黑药去除率达到50%以上时，提高进水ρ(苯胺黑药)，HRT为24 h，反应器温度通过加热棒控制在33～35 ℃.

定期(2～3 d)取样测定反应器进水、出水的ρ(CODCr) 和ρ(苯胺黑药). 所有的水样均过滤后再进行分析. 反应器运行稳定，取污泥样品进行微生物种群结构解析.

1.3分析方法

通过瑞利UV- 2100紫外/可见分光光度计对苯胺黑药进行扫描，发现苯胺黑药在λ=230 nm处有特征吸收峰. 配制苯胺黑药标准溶液系列，在λ=230 nm 处依次测定吸光度，得到标准工作曲线(y=19.06x-4.418，R2=0.998)，通过水样的吸光度值和标准工作曲线计算ρ(苯胺黑药)，然后计算苯胺黑药降解率[11].ρ(CODCr)采用标准方法[12]进行测定.

颗粒污泥粒径采用湿式筛分析法测定，通过日立S- 3400N(Ⅱ)扫描电镜观察颗粒污泥形态.

采用Miseq高通量测序解析微生物种群结构[13]. 污泥样品经DNA提取和纯化，对提取到的DNA进行琼脂糖电泳检测，查看基因组DNA的完整性与浓度. 利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应应加入的DNA量. PCR所用的引物已经融合了Miseq测序平台的通用引物. PCR结束后，对PCR产物进行琼脂糖电泳，采用生工琼脂糖回收试剂盒(cat：SK8131)对DNA进行回收. 回收产物用Qubit 2.0定量，根据测得的DNA浓度，将所有样品按照1∶1的比例进行混合，混合后充分振荡均匀. 用Miseq平台测序(Illumina公司)，所得结果进行优化. 采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似度水平的OTU代表序列进行分类学分析，分析样品的多样性以及群落结构.

2 结果与讨论

2.1苯胺黑药和CODCr的去除

在运行初期，投加葡萄糖作为进水碳源，有部分活性污泥漂浮及气泡产生，运行2 d后下沉. 如图2所示，运行到第10天，在进水中添加苯胺黑药，进水ρ(苯胺黑药)为29.04 mg/L ，出水ρ(苯胺黑药)为7.13 mg/L，降解率达到75.46%. 这是由于ρ(苯胺黑药)较低，对厌氧微生物毒性低，并且活性污泥具有吸附作用所致. 维持进水ρ(苯胺黑药)基本稳定，苯胺黑药降解率逐渐下降，最低降至45.82%；之后有所升高，至第22天达到78.31%. 驯化中期随进水ρ(苯胺黑药)的提高，出水ρ(苯胺黑药)逐步降低. 微生物此时已经有了一定的活性抗击苯胺黑药的毒性[14]. 驯化后期，由于ρ(苯胺黑药)高，降解效果波动较大，第68天时苯胺黑药降解率达到最低，仅为9.03%. 此时，ρ(苯胺黑药)高且存在累积，在一定程度上会抑制微生物的生长，停止进水6 d使微生物适应反应器内的有毒环境，至第74天降解率恢复到65.40%. 整个驯化期间降解率曲线起伏不定，但各阶段趋势是不断上升直至平稳. 厌氧污泥经过100 d的驯化，当进水碳源中ρ(苯胺黑药)达到250 mg/L时，其降解率达到70.00%左右并维持稳定，出水最低ρ(苯胺黑药)达到72.95 mg/L，降解率达70.22%.

图2 反应器进出水苯胺黑药质量浓度及其去除率随运行时间的变化Fig.2 Variation of aniline aerofloat concentration in the influent and effluent and aniline aerofloat removal efficiency with operation time

由图3可见，运行阶段ρ(CODCr)控制在500.00～700.00 mg/L，0～22 d出水ρ(CODCr)不断下降，直至50.43 mg/L，CODCr去除率达到90.27%，这是因为在驯化初期接种污泥密闭24 h后大部分有机物已经消耗，0～10 d进水碳源仅为微生物易于利用的葡萄糖，在厌氧反应器内CODCr满足了微生物生长；11～22 d低浓度的苯胺黑药对微生物的生长影响不显著. 微生物利用水中的营养物质经过代谢转化为自身物质不断生长，随着ρ(苯胺黑药)的增加，CODCr去除率有所下降，第62天之前ρ(苯胺黑药)相对较低，CODCr去除率维持在较高水平，其中在第36天和第48天测得CODCr去除率分别达到86.18%和83.59%. 苯胺黑药在该浓度驯化的后期，微生物生长已适应该浓度梯度，继续增加ρ(苯胺黑药)则直接导致出水浓度升高. 随着ρ(苯胺黑药)的增加，CODCr去除率整体较前一阶段有所降低，第80天仅为44.63%，后又逐渐升高. 至运行稳定，CODCr去除率维持在70.00%以上. CODCr去除率趋势基本与苯胺黑药降解率趋势吻合，反应器的前面隔室对有机物的去除起到主要作用[15].

图3 反应器进出水ρ(CODCr)和CODCr去除率随运行时间的变化Fig.3 Time course of ρ(CODCr) in the influent and effluent and CODCr removal efficiency

2.2颗粒污泥性状

运行初期，活性炭表面附着大量微生物，可见活性炭对微生物有很强的吸附作用，能成为微生物良好的附着载体. 运行25 d时反应器底部出现少量颗粒污泥，60 d时反应器内大量颗粒污泥形成，颗粒污泥的表面逐渐变得规则、光滑，强度逐渐提高，产气明显. 此时颗粒污泥的粒径为0.25～2.00 mm，ρ(MLSS)为28 770 mg/L，MLVSS/MLSS为0.51.

ABR反应器内不同隔室颗粒污泥的粒径分布情况见表1. 由表1可见，反应器中颗粒污泥粒径随水流方向逐渐减小，反应器内第3隔室和第4隔室颗粒污泥的粒径相对较小，维持在0.33～2.00 mm之间.

研究认为，大颗粒污泥不如小颗粒污泥活性高[16- 17]，而且截留和过滤基质也不如小颗粒污泥. 在各种运行条件下，颗粒污泥不会被冲出反应器，在试验中几乎没有发现颗粒污泥的流失.

表1 ABR反应器各隔室不同粒径颗粒污泥粒径的质量分数

启动成功后所形成的颗粒污泥形状各异，有椭圆形、球形等，也有一些颗粒污泥呈破碎状，说明此时颗粒污泥的强度还不够高，还有待通过各种运行条件的近一步优化而逐步得到提高. 颗粒污泥表面和内部的微生物并未呈现明显的分区分布，也有一些细菌以成簇、成团的方式出现，形成了一个互营共生的微生态系统. 随着运行时间增加，反应器内的颗粒污泥变得更加规则、密实、光滑，颗粒污泥微生物菌群中甲烷八叠球菌占明显优势. 颗粒表面凹凸不平，这使颗粒的比表面积明显增加，有利于泥水接触、明显提高传质效果(见图4). 颗粒污泥的表面和内部微生物排列比较松散，而且出现微生物胞外聚合物，考虑主要是微生物在苯胺黑药毒性抑制条件下，为解除环境压力而产生的[18- 19].

2.3污泥微生物群落结构解析

对ABR反应器第1、2隔室污泥进行高通量测序，分别得到 35 003 和 35 632 个有效序列，优化后进行归类，得到OTU数. 在97%相似度水平，对所有序列进行OTU划分，然后进行多样性指数分析和群落结构的分类学分析，结果见表2. Shannon-Wiener多样性指数常用来定量描述一个区域的生物多样性，其值越大，说明群落多样性越高；Chao1和ACE指数在生态学中常用来估计物种总数，可以表征菌群丰度；Simpson指数在生态学中常常用来定量描述一个区域的生物多样性，其值越大，说明群落多样性越低. 厌氧活性污泥的Shannon-Wiener多样性指数、Chao l和ACE指数较高，Simpson指数较低，表明其具有较高的菌群丰度和多样性. Coverage指数表示各样品文库的覆盖率，数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低，实际反映了本次测序结果代表样本的真实情况. 第1隔室颗粒污泥的粒径明显大于第2隔室，第1隔室承受了更大的负荷，但第2隔室却比第1隔室菌群丰度和多样性高. 有研究表明，微生物多样性与CODCr去除量有显著相关性，CODCr去除量高导致Simpson指数低[20]. 因为第1隔室对CODCr去除起主要作用，所以使得第1隔室细菌多样性低于第2隔室，这与文献[20]的研究结果一致.

图4 颗粒污泥的扫描电镜照片Fig.4 Scanning electron photomicrographs of granular sludge after the startup

隔室测序量∕条97%相似水平OTU数Shannon-Wiener多样性指数指数ACE指数Chao1指数Simpson指数Coverage指数13500355436.679620584.579912968.25610.00740.905223563259646.783023288.219814747.68010.00620.8968

在门的水平，第1、2两隔室的细菌种群分布如图5所示. 由图5可见，可以看出主要菌群为绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋菌门(Spirochaetae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和绿菌门(Chlorobi). 其中绿弯菌门菌群所占比重最大(分别为24.73%和33.60%)，其次是厚壁菌门(分别为24.17%和20.92%)和变形菌门(分别为18.93%和20.88%).

图5 在门的水平上不同隔室菌群的相对丰度Fig.5 Relative abundance of bacterial community of different compartments at phylum levels

厌氧污泥中的优势菌群绿弯菌门细菌是兼性菌，在光合作用中不产生氧气，不能固氮，主要用来分解糖类物质[21]，能降低降解苯胺黑药产物中的糖类物质. 研究[22]表明，在厌氧污泥消化器中，优势菌就是绿弯菌门. 很多厚壁菌门细菌可产生内生孢子，对脱水和极端环境有较强的抵抗力[23]，这使反应器具有较好的耐冲击负荷. 变形菌门是细菌中最大的一门，包含多种代谢种类，在常规活性污泥系统、脱氮除磷系统都存在，主要作用是降解废水中的有机物，同时完成整个系统的脱氮除磷[24, 25]. 这能去除降解苯胺黑药所产生的NO3-、PO43-. 杆菌门菌群常在除磷系统中被报道，可降解蛋白质、糖类等物质[26]. 浮霉菌门细菌是一门水生细菌，其中一类和浮霉菌属等关系较远的细菌Planctomycetessp.能在缺氧的环境下利用亚硝酸盐氧化铵离子生成氮气来获得能量，被称作厌氧氨氧化菌，对反应器内的脱氮起重要作用[27]，这与去除苯胺黑药降解产物相吻合. 此外，系统中还存在其他细菌，如蓝藻门(1、2隔室分别为0.07%和0.08%)具有固氮能力和对不良环境的抵抗能力，能增强系统的耐冲击负荷.

表3列出了在属(genus)水平上鉴定出的优势菌及其相对丰度. 综合1、2隔室，丰度最高的为Caldisericum和Leptolinea. 其中Caldisericum属于嗜热丝菌门，是一种异养的厌氧高温丝状菌，在第1隔室中Caldisericum的丰度最高，为11.00%，第2隔室为6.61%，此菌能减少硫化物，对颗粒污泥的形成[28]和苯胺黑药的降解起重要作用.Leptolinea属于绿弯菌门，在第2隔室中的丰度最高，为12.09%，第1隔室为6.41%，此菌与ABR反应器内的发酵产酸有关[29]. 其余一些丰度较低的细菌(Leuconostoc、Bacillus、Clostridium、Syntrophomonas、Azospira和Lactobacillus)属于厚壁菌门，Leuconostoc对有毒环境有很强的抵抗能力，在工业中已被广泛使用[30].Desulfovibrio属于变形菌门；Planctomyces属于浮霉菌门. 陈小清分离得到一株苯胺黑药高效降解菌死亡谷枯草芽孢杆菌Bacillusvallismortis[11]. 总体而言，在反应器中产生的种类众多的各类细菌进一步验证了反应器对苯胺黑药有降解作用.

表3 属水平鉴定出的优势菌及其相对丰度

3 结论

a) 进水ρ(苯胺黑药)和ρ(CODCr)有波动的情况下，出水苯胺黑药和CODCr去除率随反应器的稳定而逐渐升高. 在运行稳定、HRT为24 h，苯胺黑药和CODCr的去除率分别为67%～71%和68%～73%，二者趋势一致，表明ABR对苯胺黑药有良好的去除作用.

b) ABR反应器内能够出现大量颗粒污泥，随着隔室的推移，颗粒粒径呈逐渐减小的趋势，反应器内颗粒污泥规则、密实，ρ(MLSS)高达 28 770 mgL，不会随水流失，形成了能够适应苯胺黑药废水水质并降解苯胺黑药的微生物群落结构.

c) 厌氧活性污泥样品的Miseq高通量测序结果表明：在反应器第1隔室和第2隔室内，绿弯菌门菌群所占比重最大(分别为24.73%和33.60%)，其次是厚壁菌门(分别为24.17%和20.92%)和变形菌门(分别为18.93%和20.88%). 其他优势菌群有嗜热丝菌门、拟杆菌门、螺旋菌门、浮霉菌门、疣微菌门、酸杆菌门、广古菌门、芽单胞菌门和绿菌门. 在属的水平检测到Caldisericum、Leptolinea、Leuconostoc和Bacillus等.

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Treatment of Aniline Aerofloat Wastewater Using Anaerobic Baffled Reactor and Analysis of Activated Sludge Community

YANG Ziheng, SONG Weifeng*, CHENG Yajie, LI Haiyu, JIAN Jingyi

School of Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China

An anaerobic baffled reactor was developed for the treatment of aniline aerofloat wastewater, a refractory flotation regent. Scanning electron microscopy revealed the shape and properties of granule sludge from different compartments. The microbial communities that might have promary functions were further analyzed by applying Miseq high-throughput sequencing approaches. The results showed that the removal efficiency of aniline aerofloat and CODCrincreased in each stage despite their great fluctuation in the influent. At a hydraulic retention time of 24 h, aniline aerofloat and CODCrremoval reached 67%- 71% and 68%- 73% after 100 days′ operation, respectively. A large amount of granular sludge formed in the reactor, and the particles size distribution was reduced in the direction of flow. The sludge was regular, close-grained and not lost. Miseq high-throughput sequencing results showed thatChloroflexiaccounted for most of the sequence (24.73% and 33.60%), followed byFirmicutes(24.17% and 20.92%) andProteobacteria(18.93% and 20.88%) at the phylum levels. At the genus levels,Caldisericum,Leptolinea,LeuconostocandBacilluswere identified, which meant the reactor had good resistance to impact load and good degradation effect. The study indicated that ABR may be an effective remover of aniline aerofloat.

ABR; aniline aerofloat; granular sludge; Miseq high-throughput sequencing

2016-12-17

：2017-05-09

广东省科技计划项目(2014A020209077)

杨梓亨(1992-)，男，广东汕头人，454284669@qq.com.

*责任作者，宋卫锋(1972-)，男，河南郏县人，教授，硕导，主要从事水污染控制理论与技术研究，weifengsong@263.net

X703.1

：1001- 6929(2017)09- 1448- 07

ADOI：10.13198/j.issn.1001- 6929.2017.02.72

杨梓亨,宋卫锋,程亚杰,等.ABR反应器处理苯胺黑药废水及其微生物种群结构[J].环境科学研究,2017,30(9):1448- 1454.

YANG Ziheng,SONG Weifeng,CHENG Yajie,etal.Treatment of aniline aerofloat wastewater using anaerobic baffled reactor and analysis of activated sludge community[J].Research of Environmental Sciences,2017,30(9):1448- 1454.