隐丹参酮联合曲美替尼诱导胃癌细胞凋亡作用及其机制

付娟 刘培⋆

隐丹参酮联合曲美替尼诱导胃癌细胞凋亡作用及其机制

付娟 刘培⋆

目的 研究隐丹参酮增强MEK抑制剂曲美替尼诱导胃癌细胞MGC803凋亡的作用及其分子机制。方法 选用对数生长期的MGC803细胞，将其分为对照组、隐丹参酮组、曲美替尼组和隐丹参酮组/曲美替尼组联合用药组。采用CCK-8法检测隐丹参酮对曲美替尼增殖的影响，PI/Annexin-V双标记流式细胞术检测凋亡率的变化，Western blot检测STAT3及ERK等激酶的变化以及凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9和PARP的水平。结果 隐丹参酮显著增强曲美替尼对MGC803细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用，细胞的促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9和PARP显著激活；曲美替尼可显著抑制MGC803细胞ERK磷酸化水平，但同时可见STAT3磷酸化水平明显升高，而隐丹参酮联合曲美替尼可同时显著抑制ERK和STAT3的磷酸化水平。结论 STAT3在曲美替尼作用胃癌细胞MGC803的过程中被显著激活，联合应用STAT3抑制剂隐丹参酮可逆转STAT3的活化，从而增强曲美替尼诱导MGC803凋亡作用。本研究为MEK抑制剂曲美替尼和STAT3抑制剂隐丹参酮联合治疗胃癌提供了新的实验依据，为胃癌的临床治疗提供新的选择。

曲美替尼 隐丹参酮 胃癌 STAT3 细胞凋亡

胃癌是我国发病率居第二位﹑病死率居第三位的恶性肿瘤，5年总体生存率仅为30%，严重威胁着人类健康［1］。胃癌患者多数在就诊时已处于进展期，即便是根治性切除，局部复发率仍高达＞50%［2］。分子靶向治疗具有高效﹑低毒等特点，成为继手术﹑化疗﹑放疗后的一种新的胃癌治疗手段。MEK抑制剂曲美替尼（Trametinib）是一种高特异性的﹑有效的MEK1/2抑制剂，通过靶向抑制MEK1和MEK2，可有效抑制肿瘤的生长［3］，但临床实验表明，曲美替尼单独用药疗效欠佳，临床上多与其他药物联合使用［4］。隐丹参酮（Cryptotanshinone，CPT）是来自中药丹参的单体化合物，具有抑制肿瘤细胞增殖﹑诱导肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤细胞分化等多种抗肿瘤活性。本研究观察CPT酮联合曲美替尼诱导胃癌细胞凋亡的作用，为曲美替尼联合用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞﹑药物及主要试剂 胃癌MGC803细胞系购自中国科学院上海细胞库；MEK抑制剂曲美替尼（Trametinib）﹑STAT3抑制剂CPT购自Selleck；胎牛血清购自南美GIBCO公司；胰酶﹑PBS﹑PIMI-1640培养基购自杭州科易生物技术有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自日本同仁公司；RIPA细胞裂解液购于Beyotime公司；蛋白酶抑制剂﹑磷酸酶抑制剂购于Merck公司；1.5M Tris-CI PH8.8﹑1M Tris-CI PH6.8﹑1M Tris-CI PH7.4购自北京普利莱基因技术有限公司；30%丙烯酰胺﹑PVDF膜（0.2μm）﹑蛋白浓度测定试剂盒﹑ECL显影试剂购自美国BIO-RAD公司；一抗ERK﹑pERK﹑STAT3﹑pSTAT3Tyr705﹑β-actin﹑PARP﹑Cleaved-casepase3﹑Cleaved-casepase9等以及二抗均购自美国CST公司。1.2 细胞培养 胃癌MGC803细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养于37℃﹑5%CO2和95%湿度的细胞培养箱。细胞单层贴壁生长，每2天按1：3传代培养。

1.3 CCK-8检测细胞增殖 MGC803制成3.5～5×104/ ml的细胞悬液，以200μl/孔接种于96孔板，培养过夜。不同浓度的Trametinib或CPT单独或联合处理细胞24h，0.01%的DMSO处理细胞作为空白对照。每孔加入20μl的CCK-8，混匀后继续孵育1～4h左右，Thermo VARIOSKAN FLASH多功能酶标仪以450nm波长检测吸光度值，计算细胞的存活率和各组药物的抑制率。

1.4 Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡/ PI MGC803细胞以15～18×105每孔接种于6孔板，培养过夜，10μm的Trametinib﹑15μm的CPT单独或联合处理细胞24h，0.01%的DMSO处理细胞为空白对照。不含EDTA的胰酶收集细胞，PBS清洗一遍后重悬于100 μl的1×Binding Buffer，加5μl Annexin V-FITC 室温避光孵育15min，然后加入碘化丙啶（PI）染料5μl继续孵育5min，补加400μl 1×Binding Buffer，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5 Western blot检测蛋白表达水平及蛋白磷酸化水平 MGC803细胞正常培养于细胞培养瓶，Trametinib﹑CPT单独或联合处理细胞，0.01%的DMSO处理细胞为空白对照。RIPA细胞裂解液（含有蛋白酶抑制剂﹑磷酸酶抑制剂）收集各组细胞，提取细胞总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同大小蛋白，电转移至PVDF膜（300mA﹑2h）。转膜结束后，5%脱脂奶粉室温封闭2h。一抗（稀释比例1：1000）4℃孵育过夜，以β-actin为内部参考用1×TBST （pH 7.5 1mol/L Tris·HCL，NaCl，0.2% Tween-20） 清洗3次，10min/次。二抗（稀释比例1：1000）室温孵育2 h。用1×TBST清洗3次后，将ECL显影液均匀加至膜上，凝胶成像系统Chemi Dox XRS（BIO-RAD）采集图像。

2 结果

2.1 CPT和曲美替尼协同抑制胃癌细胞MGC803的增殖作用 与对照组相比，Trametinib 7.5μm﹑10μm和CPT 7.5μm作用24h对胃癌细胞MGC803的增殖均无明显抑制作用（见图1A和图1B）；CPT 10μm和15μm具有一定的抑制作用，但CPT（10μm和15μm）和Trametinib（10μm）联合作用时，抑制效果明显增强（P＜0.05）（见图1B），说明两种药物对MGC803具有协同抑制作用，抑制率达到（78.99±5.07）%。

2.2 CPT和曲美替尼协同诱导胃癌细胞MGC803凋亡作用 为观察Trametinib和CPT对细胞MGC803凋亡的影响，采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率。Trametinib（15μm）或CPT（10μm）处理细胞24h后，细胞凋亡率分别为17.51%和51.95%，而二者联合处理组的细胞凋亡率为94.11%，Trametinib和CPT具有明显的协同诱导凋亡作用。提取细胞总蛋白，Western blot检测PARP等凋亡标记蛋白的活化，联合用药组PARP﹑Casepase3和Casepase9均明显被活化，说明Trametinib与CPT协同作用于MGC803细胞可诱导细胞发生凋亡。

图1 CPT和曲美替尼协同抑制胃癌细胞MGC803的增殖

2.3 曲美替尼对胃癌MGC803细胞STAT3和ERK磷酸化水平的影响 Trametinib是高特异性MEK1/2抑制剂，可显著抑制MEK-ERK信号通路，作者检测了Trametinib对ERK的抑制作用。10μm Trametinib处理MGC803细胞不同时间，Western blot检测ERK﹑STAT3等蛋白的磷酸化水平和蛋白表达水平。Trametinib处理细胞2h即可显著抑制ERK磷酸化水平，而ERK蛋白表达水平在2～16h均无明显变化，说明Trametinib可有效抑制MGC803细胞MEK-ERK通路。但同时可见，Trametinib处理细胞8h后STAT3磷酸化明显持续活化，而STAT3蛋白表达水平无明显变化。以上结果提示，Trametinib在抑制MEK-ERK通路后，可能导致了STAT3的旁路激活，STAT3的激活可导致MGC803对Trametinib的敏感性降低。

2.4 CPT联合曲美替尼处理胃癌细胞MGC803后STAT3和ERK磷酸化水平的变化 10μm Trametinib与15μm CPT单独或联合处理MGC803细胞8h，Western blot检测ERK﹑STAT3等蛋白的磷酸化水平和蛋白表达水平。结果显示，Trametinib单独处理细胞可显著抑制ERK磷酸化，但同时可明显激活STAT3磷酸化；而CPT单独处理细胞可显著抑制STAT3磷酸化，同时明显激活ERK磷酸化水平；当Trametinib和CPT联合处理细胞时，发现STAT3和ERK的磷酸化水平均被显著抑制。结果说明，Trametinib和CPT对MGC803的协同诱导凋亡作用可能是源于对STAT3和ERK的联合抑制。

3 讨论

Ras/Raf/MEK/ERK通路的异常与肿瘤的发生密切相关，由于其导致细胞增殖失控和凋亡受阻，因此可作为肿瘤治疗的一个靶点。MEK抑制剂曲美替尼是一种高特异性﹑有效的MEK1/2抑制剂，通过对MEK蛋白的作用，影响ERK的活性，抑制细胞增殖［5-7］。但有研究表明，和其他靶向药物一样，曲美替尼治疗一定时间后，可导致STAT3的异常激活，使肿瘤细胞对曲美替尼的敏感性明显降低，降低药物疗效［8］。信号传导和转录激活因子（STAT3）与肿瘤关系密切，异常活化的STAT3信号通路通过对下游靶基因的转录激活作用，促进肿瘤细胞增殖和浸润转移，抑制细胞凋亡，促进肿瘤血管生成，其异常活化与肿瘤的发生﹑发展及预后密切相关。本研究中，曲美替尼处理胃癌细胞MGC803 8h后即可见STAT3磷酸化水平显著上升，曲美替尼单独处理24h对MGC803并无明显的增殖抑制作用，说明STAT3的激活可能对胃癌细胞曲美替尼敏感性有一定影响，曲美替尼联合STAT3抑制剂可能具有更强的抗肿瘤作用。

CPT是从丹参中提取的单体化合物，具有抗菌消炎﹑降温﹑抗氧化等作用，近年多项研究证实其具有较好的抗肿瘤活性。有研究表明，CPT可抑制STAT3的磷酸化﹑抑制STAT3二聚体形成及入核，从而抑制STAT3的活性［9］。本研究结果也显示，CPT可显著抑制STAT3磷酸化水平，CPT和曲美替尼明显协同诱导MGC803发生凋亡。同时可以看到，CPT单独处理细胞MGC803后可见ERK磷酸化水平明显上升，曲美替尼单独处理细胞MGC803后STAT3磷酸化明显上升，而CPT联合曲美替尼处理细胞后ERK和STAT3磷酸化水平均显著降低，预示二者的协同诱导凋亡作用与其分别抑制STAT3和ERK的活性有关。

本研究结果表明，曲美替尼抑制ERK活性的同时可导致STAT3的活化，而CPT抑制STAT3的同时可导致ERK的活化，而联合用药后可同时有效抑制ERK和STAT3，从而达到更好的抗肿瘤效果。关于对下游靶基因的调控以及对细胞周期凋亡等的影响需进一步研究。

综上所述，分子靶向药物已成为肿瘤治疗的一个重要研究方向，研究肿瘤发病机制及药物作用机制对肿瘤的靶向治疗非常重要。靶向药物单独应用时容易出现耐药性，降低药物的治疗效果，联合用药是肿瘤治疗的必然趋势。本研究为MEK抑制剂和STAT3抑制剂联合治疗胃癌提供了新的理论依据，有望为胃癌的临床治疗提供新的选择。

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Objective To investigate the synergistic effects of combining Cryptotanshinone （CPT） and MEK1/2 inhibitor trametinib on inducing apoptosis in human gastric cancer cell MGC803 and associated mechanisms. Methods The MGC803 cells at logarithmic growth phase were divided into CPT group， trametinib group， CPT/trametinib combination group and control group. The cell proliferation and cell apoptosis were detected by CCK8 assay and AnnexinV/PI staining， respectively. The expression levels of p-ERK， p-STAT3 and the cleaved form of caspases and PARP were tested by western blot. Results Cryptotanshinone signifi cantly enhanced the anti-proliferative and pro-apoptotic effects of trametinib in MGC803 cells. Apoptosis induced by combination of CPT and trametinib was accompanied with increased expression of cleaved -caspase-3， caspase-9 and PARP. Further studies revealed that trametinib signifi cantly suppressed the phosphorylation of ERK， while increased the phosphorylation of STAT3. The combination of CPT and trametinib signifi cantly decreased the phosphorylation of both of ERK and STAT3. Conclusion STAT3 is signifi cantly activated in gastric cancer cell MGC803 when treated with trametinib. The STAT3 inhibitor CPT can reverse the activation of STAT3， thereby enhance the anti-cancer effect of trametinib in MGC803. This study provides new experimental evidence for treatment of gastric cancer with combination of CPT and MEK inhibitor. Our strategy would provide new choice for clinical treatment of gastric cancer.

Trametinib Cryptotanshinone Gastric carcinoma STAT3 Apoptosis

310053 浙江中医药大学（付娟）

310006 浙江中医药大学附属第一医院（刘培）

*通信作者