耐镉根际促生菌的筛选及其对一年生黑麦草镉吸收积累的影响

赵会会， 方志刚,2， 马 睿， 娄来清， 蔡庆生*

(1. 南京农业大学生命科学学院， 江苏 南京210095；2. 喀什大学， 新疆 喀什 844000；3. 江苏省泰兴市国土资源局， 江苏 泰兴 225400)

过去数十年以来，由于工农业的快速发展，如矿产开发、污水灌溉、杀虫剂滥用及化肥过度施用，导致农田土壤及水源受到污染，其中重金属污染成为全球面临的环境问题之一[1]。2014年国家环境保护部和国土资源部的全国土壤污染调查报告显示：全国土壤无机污染物超标点位数占全部超标点位的82.8%，其中镉(Cd)被鉴定为一种主要的无机污染物，其位点超标率达7.0%[2]。镉在土壤中具有较强的移动性，易被作物吸收并在可食部位积累，这不仅影响作物产量和品质，还可通过食物链给人类健康带来潜在威胁[3]。因此，农田土壤镉污染修复刻不容缓。目前，因治理重金属污染土壤的物理、化学方法成本高且容易给环境带来二次污染，不易大面积推广，而成本低廉、环境友好植物修复技术受到广泛关注[4-5]。然而，用于修复重金属污染土壤的超积累植物因生长缓慢、生物量低，植物体难以回收利用等问题限制了其在实际中的应用[5-6]。

植物根际促生细菌(PGPR)是生活在植物根际的一类能促进植物生长、防治植物病害、提高农作物产量的有益细菌[7]。目前已经报道的根际促生菌主要包括芽孢杆菌属、肠杆菌属、假单胞杆菌属等[8]。植物根际促生菌可通过分泌生长素、1-氨基-1-羧基环丙烷脱氨酶(ACCD)以及溶磷作用等促进植物的生长[9-10]，增加其生物量；还可以通过分泌有机酸、生物表面活性剂等提高土壤中重金属的生物有效性来增加植物对重金属的吸收量，从而提高植物修复效率[11-12]。近年来，应用植物联合微生物修复重金属污染土壤取得重要理论成果，已经证明对油菜(BrassicanapusL.)、玉米(ZeamaysL.)等接种PGPR均可提高其对重金属胁迫的耐受性[13-15]，但田间应用仍相对匮乏。

一年生黑麦草(LoliummultiflorumLam.) 是一种重要的牧草，具有适应性广、生长快和生物量大等特点[16]；有研究表明一年生黑麦草具有较高的生物乙醇转化率，已经被应用到发酵等工业领域[17-18]。另有研究指出一年生黑麦草能富集镉、铜等重金属，可作为修复重金属污染土壤的候选植物[19-20]。本研究试图利用PGPR增强一年生黑麦草的耐镉性和吸收积累镉的能力，旨在为利用和修复重金属污染土壤、避免与粮饲争地、在重金属污染土壤上开发能源植物提供可行的调控途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

植物样品采自云南个旧市鸡街镇(E 103°12′～103°16′、N 23°29′～23°33′)重金属污染区。一年生黑麦草品种为'‘牧瑶’(IdyII)，由北京正道生态科技有限公司提供。

1.2 供试土壤

盆栽试验土壤取自江苏省南京市玄武区某公园土，室内风干过2 mm筛。土壤理化性质为：pH 7.35±0.07，速效磷39.95±0.28 mg·kg-1，速效钾13.84±18.87 mg·kg-1，总镉0.76±0.01 mg·kg-1，总铜30.72±0.66 mg·kg-1，总铬56.10±0.75 mg·kg-1。

1.3 耐镉植物根际促生细菌的分离筛选与鉴定

1.3.1菌株分离 用小刷子将植物样品根际土刷下来，称取0.1 g土样加到含有1 mL无菌水的灭菌离心管中。利用10倍稀释法稀释土壤菌悬液，分别从稀释度为10-4，10-5，10-6的稀释液中取0.1 mL菌悬液涂布在LB(Luria-Bertani)平板上，28℃培养72 h后，记录细菌数量。从平板上随机挑取不同表型的单菌落按常规方法纯化后用灭菌牙签依次挑至镉浓度为0.1，1.0 和2.0 mM的LB平板上。选择耐镉能力较强、生长稳定的菌株转至斜面4℃条件下保藏。

1.3.2耐镉菌株促生特性鉴定 菌株发酵液中吲哚乙酸(IAA)的测定参考Gordon[21]的方法，ACC脱氨酶能力测定参考夏娟娟[22]的方法，溶磷能力的定性测定参考黄静[23]的方法。

1.3.3复筛 菌悬液的制备：将具有促生特性的耐镉根际菌活化后接入液体LB培养基中，30℃、160 r·min-1摇床培养24 h。3 000 r·min-1离心10 min后收集菌体，用无菌水洗涤后稀释至OD600=1备用。

平皿促生试验：用10% H2O2对黑麦草种子进行表面灭菌，浸泡15 min后用水洗净。平皿中Cd2+浓度为100 uM，每个平皿随机播入植物种子30颗，接种己制备好的菌悬液5 mL，对照用无菌水处理，每个处理3次重复。置于25℃培养箱培养8天后测量根长、芽长进行统计分析。

1.3.4菌株分类地位鉴定 菌株总DNA的提取方法参考杨清[24]，利用细菌16SrDNA通用引物(5′端引物序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；3′端引物序5'-TACCTTGTTACGACTT-3′) 进行PCR扩增。PCR产物纯化后进行TA克隆，将含有目的基因的质粒载体导入大肠杆菌感受态细胞，然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，得到转化菌落。挑选白色菌落(含重组质粒)在无选择抗性的培养基中培养，并通过扩增进行重组子鉴定，选取电泳结果含有目的基因的大肠杆菌菌液，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果在GenBank中与相关序列进行同源性比对。

1.4 盆栽试验

1.4.1试验设计 盆栽试验在南京农业大学牌楼实验基地日光温室内进行，土样风干后过1 cm筛。重金属镉以CdCl2·2.5H2O水溶液加入土中混合均匀，土壤镉浓度参考Guo[25]关于黑麦草盆栽镉处理的试验条件，并结合本课题组前期的预试验结果，使盆钵中土壤镉终浓度为20±0.33 mg·kg-1，采用大小为19 cm×20 cm的塑料盆，每盆装土约4 kg，自然平衡2周。以无菌水浸种为对照，以筛选后的菌株(A02、Oj06和Ps08)菌悬液为处理，浸种约2 h。设置3次重复。每盆播种30粒种子，萌发10天后间苗，每盆留生长一致的苗10株。分别在播种10天、30天后在植物根系周围接入相应的供试菌株的菌悬液(菌悬液制备同上)，每盆15 mL，对照接入等体积的无菌水。

1.4.2样品的预处理及测定 60天后，记录各处理黑麦草分蘖数、株高。将黑麦草沿土壤表面剪下分成地下和地上两部分，用水冲洗干净，测定各处理地上、根部的鲜重；后将黑麦草置于105℃烘箱内杀青30 min，60℃下烘干至恒重，用于测定植物干重。同时收集各盆中根际土壤，风干后按李强和刘铭[26-27]的方法测定土壤pH和有效态镉含量。植物经微波消解后用电感耦合等离子发射光谱仪测镉离子浓度。叶片丙二醛(MDA)含量测定参考李合生[28]的方法。

1.5 数据分析

利用Excel 2007整理数据，SPSS 20.0进行方差分析，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 耐镉菌株的筛选及促生特性的鉴定

从不同植物根际土中共分离出136株细菌。在镉浓度为2.0 mM的初筛培养基上生长良好的菌株共32株，其中具有产IAA能力的菌株共6株，产ACC 脱氨酶能力的菌株共7株，具有溶磷能力的菌株共8株。经过平皿促生试验的复筛，选取A02，Oj06，Ps08做进一步研究。3种菌株均具有溶磷能力，此外A02和Ps08还具有分泌生长素的能力，Oj06具有产ACC 脱氨酶的能力(表1)。

表1 耐镉菌株促生特性Table 1 Characteristics of cadmium-tolerant strains

2.2 根际菌A02，Oj06，Ps08的形态学特征及16SrDNA序列分析

测序结果通过BLAST软件与GenBank中其他菌株的16S rRNA基因序列进行比对，结合菌株的菌落和菌体特征将菌株鉴定到属。 A02为荧光假单胞杆菌属(Pseudomonassp.)，Oj06和Ps08为肠杆菌属(Enterobactersp.)(表2)。

表2 菌株16S rRNA基因序列分析结果Table 2 The identification of the tested strains based on 16S rRNA gene analysis

2.3 耐镉根际促生菌对一年生黑麦草植株生长以及叶片中MDA含量的影响

不接菌(对照)植株的生长受到明显抑制，接种耐镉促生菌株处理的植株分蘖数和株高均显著(P<0.05)增加。 接菌A02，Oj06，Ps08的植株平均分蘖数分别比对照高31.67%，28.33%，26.65%，平均株高分别比对照高出18.44%，19.20%，18.62%(图1)。表明耐镉促生菌A02，Oj06，Ps08能够有效促进一年生黑麦草在镉污染土地中的生长。

图1 镉胁迫下不同菌株处理对一年生黑麦草分蘖数和株高的影响
Fig.1 Effects of strains on tiller number and shoot height of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress
注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同
Note: Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same below

与对照相比，不同菌株处理下一年生黑麦草地上部以及根干重均有所提高。接菌A02，Oj06，Ps08处理的黑麦草地上部干重与对照相比，分别增加了45.32%，38.63%，49.42%，差异均达显著(P<0.05)水平(图2)。结果表明：耐镉促生菌株适度镉污染条件下对一年生黑麦草有一定的促生作用，能够在一定程度上缓解镉胁迫对植物生长的抑制。

图2 镉胁迫下不同菌株处理对一年生黑麦草干重的影响
Fig.2 Effects of strains on dry weight of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress

镉胁迫下及接种耐镉根际促生菌后，一年生黑麦草叶片中丙二醛含量变化如图3所示。接种A02，Oj06，Ps08后，一年生黑麦草叶片中MDA含量分别比对照降低44.43%，41.28%，38.61%，差异达到显著水平 (P<0.05)。由此可见，3株菌均能降低镉胁迫下黑麦草叶片中的膜脂过氧化产物，从而可能缓解镉对一年生黑麦草产生的毒害。

2.4 耐镉根际促生菌对一年生黑麦草镉吸收积累的影响

如表3所示，接种A02，Oj06和Ps08后，一年生黑麦草地上部和根系内镉浓度与对照相比无显著变化。然而，接种不同耐镉根际促生菌后，一年生黑麦草镉吸收总量变化较为明显。接种A02，Oj06，Ps08后，黑麦草地上部镉吸收总量分别比对照增加了48.78%，33.98%和50.01%，差异达显著水平 (P<0.05)；与对照相比，接种不同根际菌，黑麦草根系镉积累总量亦有所增加，其中接种Oj06的处理增加了57.64%，差异显著(P<0.05)。接种3株菌后，根际土壤中有效态镉含量分别增加了19.14%，13.39%，7.48%，其中接种A02的处理达到显著差异(P<0.05)。与对照相比，接种A02，Oj06，Ps08后，根际土壤pH分别下降3.52%，2.80%，1.76%，其中接种A02，Oj06的处理达到显著差异(P<0.05)。

图3 镉胁迫下不同菌株处理对一年生黑麦草叶片MDA含量影响
Fig.3 Effects of strains on MDA content of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress

表3一年生黑麦草镉的吸收积累情况以及根际土壤有效态镉含量与pH
Table 3 Influence of strains on Cd concentration and total Cd accumulation ofLoliummultiflorumLam. ,pH and extractable Cd concentration in the rhizosphere

不同处理Treatments镉含量Cd concentration/μg·g-1单株镉吸收总量Cd accumulation/μg·株-1地部 Shoot根系 Root地上部 Shoot根系 Root土壤有效态镉含量Extractable Cd concentration/mg·kg-1土壤pHSoil pHCK17.58±1.04a176.34±20.56a4.27±0.29b21.26±3.67b12.58±0.56b7.39±0.06aA0218.63±3.26a193.37±5.27a6.36±0.47a31.96±3.54ab14.98±0.89a7.13±0.02bOj0617.04±0.95a192.28±5.59a5.73±0.13a33.51±2.40a14.26±0.32ab7.18±0.06bPs0817.80±1.25a171.03±3.86a6.41±0.31a29.16±2.96ab13.51±0.31ab7.26±0.02ab

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at the 0.05 level

3 讨论

近年来，有关土壤重金属污染修复的研究不断深入，利用微生物-植物联合修复镉污染土壤成为一种新的技术途径。大量研究表明，PGPR可显著促进植物生长，提高植物对重金属的抗性，从重金属污染土壤中分离到的PGPR常表现出较强的重金属耐性[29-30]。

本研究鉴定了耐镉根际促生菌，发现A02和Ps08具有较强的IAA分泌能力；Oj06能在以ACC为唯一氮源的培养基上生长，说明其具有ACC脱氨酶活性；3株菌均具有溶磷能力，这表明他们均具备潜在的促生能力。

Asghar等[31]将产IAA的促生菌接种到油菜(BrassicanapusL.)后，植株分枝数量和株高能够显著增加，这与本研究中一年生黑麦草分蘖数、株高显著增加(图1)的结果相似，其原因可能是PGPR能够产生IAA，促进植物根系的生长发育，可能增加土壤中的水分和养分的吸收，从而促进植物的生长以提高植物的抗逆性[32]。从图2可以看出，3株促生菌能显著提高黑麦草地上部干重，这一结论与Jiang等[33]研究根瘤菌对番茄(SolanumlycopersicumL.)和玉米的结果较为相似。在逆境条件下，作为乙烯合成的前体会产生大量ACC，植物根际促生菌能通过合成ACCD将ACC分解成氨和α-丁酮酸，抑制植物体内乙烯的大量生成，同时为植物提供氮源从而增加植物的生物量[9]。一年生黑麦草生物量的增加还可能与3株促生菌分泌IAA，ACC脱氨酶以及溶磷能力有关[32,34]。此外，一些植物促生菌能分泌有机酸，降低植物根围土壤的pH值，将不溶性的磷转变成可溶性的磷，使磷有效地溶解与吸收从而促进植物生物量的增加[35]。

植物在逆境条件下，细胞质膜中不饱和脂肪酸会发生过氧化反应而产生丙二醛，是反映细胞膜脂过氧化强弱的重要指标[36]。本研究中，促生菌处理下一年生黑麦草叶片中MDA含量显著下降，表明接菌后降低了镉对叶片细胞膜的损伤程度，从而减轻了黑麦草叶片中膜脂过氧化反应，这一结论与田野等[37]研究镉污染土壤接种丛枝菌根真菌对黑麦草叶片中MDA含量影响的结果一致。

分析一年生黑麦草植株内镉含量，无论是地上部分还是根系，接菌后镉含量有所提升但差异不显著，这与刘莉华[38]等的报道相同，可能是由于接种促生菌后能促进植物的生长，提高植株的生物量，体内吸收的镉由此表现出一定的“稀释”作用。本研究中，接种促生菌对一年生黑麦草镉吸收的影响更多的体现在镉积累方面。各接菌处理相比于对照镉积累总量均显著增加，这是由于植物根际促生菌增加了一年生黑麦草的生物量，从而也使其镉积累总量增加。这一结论与Guo等[25]的结果一致。接菌处理后土壤中有效态镉含量有所增加，而土壤pH则显著下降，可能是3株菌均具有溶磷作用，能够通过分泌有机酸溶解土壤中的磷酸盐使之成为植物可吸收利用的形态，这为土壤中重金属的活化提供了有利条件，从而促进植物对重金属的吸收[11]。

4 结论

从不同植物根际土壤中筛选出3株具有较强耐镉性的根际促生菌，接菌后一年生黑麦草的分蘖数、株高、生物量均显著高于对照，叶片中丙二醛含量显著降低。就植株体内镉含量而言，接种菌株后地上部和根系的镉含量与对照相比无显著差异， 但其总的吸收量却显著增加，这预示在镉污染土地上种植一年生黑麦草若接种A02，Oj06，Ps08，通过多次收获黑麦草地上部分，可有效减少土壤中镉含量，说明PGPR具有比较理想的应用前景。此外, 本试验采用的是温室盆栽，田间根际微生物受环境因素(如温度、肥料、水分、土壤理化性质等)的影响较大，耐镉根际促生菌在田间镉污染环境下对一年生黑麦草的促生及积累效果还有待进一步研究。