食品微生物检验中ATP发光法的应用

曾翠平 庞素兰

408200重庆市丰都县疾病预防控制中心

食品微生物检验中ATP发光法的应用

曾翠平 庞素兰

408200重庆市丰都县疾病预防控制中心

近些年来食品安全问题突出，已经成为社会焦点问题之一。因此，需加强食品检测工作，保证食品安全。随着生物技术的不断发展，食品检验技术日益进步，ATP生物发光检测法因其灵敏度较高且操作便捷，已被广泛应用。本文首先对生物检验技术在食品检测中应用的重要性进行分析，其次对ATP发光法的作用原理进行阐述，然后就食品微生物检验中ATP发光法的具体应用进行总结。

ATP发光法；微生物检验；食品安全

食品卫生关乎人们的身体健康与生命安全，是人们普遍关注的一个社会问题。随着人们对食品卫生质量要求的不断提高，食品卫生检验技术也在不断地完善和进步。微生物检验是确保食品安全卫生的一个重要环节，是对食品质量的重要保障。但是，在食品微生物检验的过程中，影响检验质量的因素是多方面的，如果不能很好地对这些影响因素进行有效控制，检验结果就可能有很大的偏差，使得食品卫生无法得到保证。因此，对食品微生物检验的质量控制进行全面的探究是非常重要的。

食品检验中现代生物技术应用的重要性

一个较高品质的食品安全方面的检验能够在一定程度上保证食品的安全性。最近这些年我们国家对于食品安全的问题越来越重视，借助了现代生物理论作为基础，现代生物技术能够应用到的领域也变得越来越广泛了。除此以外，生物技术在近些年越来越有优势，有更加安全并且环保、能够精准地进行测试和检验等特点，在食品的安全检验当中运用得十分顺手。要保证食品的安全性，传统的生物以及食品的检验技术是不具有相关的优势的，现代生物技术具有良好的发展前景。为此，本文以ATP技术为例对其检测方法进行深入探究。

ATP生物发光法分析

ATP生物发光法是一种较为高效且操作便捷的检测方法，只需几分钟便可得到检测结果[1]。技术原理为将细菌内的ATP从自由可溶解的状态中释放出来，在有荧光素酶、镁、氧气存在的条件下和虫荧光素发生反应产生荧光，通过对荧光信号的判断对ATP的含量进行推测和计算，以检测样品中的含菌量。其反应过程如图1所示。以往ATP生物发光仅用于细菌、酵母以及其他真菌的检测工作中。但其缺陷是灵敏度不高，对于细菌数量也有严格限制，一般在103～104CFU/mL。相关技术人员以及学者研究开发了ATP再生系统，提高了此方法的灵敏度，从而有效弥补了传统ATP发光法的缺陷。所谓ATP再生系统就是指利用生物发光主反应产生的焦磷酸以及AMP作试剂[2]，并添加相应的底物以及酶系，促进PPI或者是AMP产生ATP，使得反应体系的荧光信号更强，检测结果更加直观。但是该测验体系也存在不足之处，如反应体系中的酶较多，酶促反应会相互影响，对测验结果造成影响，重复性较差。

图1 ATP再生途径

食品微生物检验中ATP发光法的应用(以酸奶Fe3O4检测为例)

试验方法：①化学发光检测：将氨基改性的Fe3O4纳米粒子1.0 μmol取出，使用吡啶缓冲液，并添加适量的戊二醛溶液，通常添加量200 μL，放置于室温环境下，对其进行持续振荡3 h。对其进行反复清洗，然后将10 pmol ATP适体加入，持续振荡1 h，同样放置于室温环境下，随后进行反复清洗。采用的是WB清洗液，将200 μL 2%的BSA溶液加入其中，持续振荡，时间1 h，温度同样为室温。采用WB清洗液对其进行的反复清洗，再将Fe3O4纳米粒子置于ATP(浓度 2、4、6、8、10、12 μmol/L)溶液100 μL中，室温下进行持续1 h的振荡。使用WB清洗液反复清洗，进行磁性分离，然后使用超纯水将Fe3O4纳米粒子转移至圆柱形玻璃瓶中，此圆柱形玻璃瓶一端开口，将其放在BPCL微弱发光仪中，添加荧光素酶缓冲液90 μL，测量荧光发光强度，将出现最高信号值后的10 s的积分值作为最终信号值。②对ATP的特异性利用化学发光法进行检测及进行干扰性实验：取出氨基改性的Fe3O4纳米粒子1.0 μmol，反复清洗，采用的是吡啶缓冲液，并将适量的戊二醛溶液添加其中。通常添加量200 μL，持续振荡3 h，然后加入ATP适体10 pmol，持续振荡1 h。随后进行反复清洗，采用WB清洗液，添加2%的BSA溶液200 μL，持续振荡1 h。上述持续振荡的温度环境均是室温，使用WB清洗液反复清洗，将10 μmol/L的ATP溶液加入CTP溶液、UTP溶液、空白AA缓冲液、ATP和GTP混合液、ATP和CTP混合液、GTP溶液之中，ATP、GTP、CTP和UTP混合液、ATP和UTP混合液，浓度均100 μL，持续振荡1 h，同样是室温环境。反复洗涤，使用的是WB清洗液，磁性分离。然后使用超纯水10 μL将Fe3O4纳米粒子转移至一端开口的圆柱形玻璃瓶，将其放在BPCL微弱发光仪中待测，添加荧光素酶缓冲液90 μL，测量样品的荧光强度[3]。

结果：根据检测结果绘制了曲线图。由图可知，当R2=0.996 3时，其范围内的线性良好，适用于ATP的定量检测。化学发光法检测ATP干扰性的试验结果：当溶液为CTP、GTP、UTP时，荧光强度较低；当溶液为ATP、CTP、GTP、UTP的混合物时，不会对荧光强度造成较大影响，实验的可行性较高。对酸奶中的ATP进行检测，提取出乳酸菌中ATP，再对Fe3O4纳米粒子进行实验，特异性捕获ATP，化学发光法检测其发光值。试验结果显示当乳酸菌的含量越大时，提取的ATP量越大，化学发光值也会提升，实验的重复性较为突出。依据图2绘制的ATP工作曲线进行计算可知每mL酸奶的乳酸菌中所含ATP的量为3.98×10-8mol，由此可见本次试验制备的Fe3O4纳米粒子可作为载体应用于分析食品检测领域，见图2、图3。

综上所述，ATP发光法仍然存在不足，将其应用于食品检测工作时需要科学地制定试验流程，合理配置试验试剂，才能保证试验的可行性和有效性。同时，需加强技术研究，完善该检测技术，提高灵敏度，增强其对抗干扰能力。

图2 化学发光检测ATP工作曲线

图3 不同溶液中ATP发光值的测定

[1]王福厚,张士珍,李娟.ATP生物发光技术在微生物快速检测中的应用[J].国外畜牧学-猪与禽,2015,35(5)：89-90.

[2]刘翔军.食品微生物检测新技术及发展趋势[J].广东化工,2013,40(1)：75-76.

[3]李海月,黄继红,张新武,等.ATP生物发光法快速检测食源性致病菌的研究[J].河南工业大学学报(自然科学版),2016,37(1)：67-71.

Application of ATP bioluminescence method in microbiological examination of foods

Zeng Cuiping,Pang Sulan
Center for Disease Control and Prevention of Fengdu County,Chongqing City 408200

In recent years,food safety issues have become prominent,and has become one of the social problems.Therefore,it is necessary to strengthen food testing work to ensure food safety.With the development of biotechnology and the progress of food inspection technology,ATP bioluminescence detection method has been widely used because of its high sensitivity and convenient operation.In this paper,the importance of biological detection technology in food testing was analyzed firstly,secondly,the principle of ATP luminescence method is expounded,and then the specific application of ATP luminescence method in food microbiological examination is summarized.

ATP chemiluminescence method;Microbiological examination;Food safety

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.24.90