Wnt 信号通路对骨髓瘤病的影响

王晋+郑亚萍

摘 要：目的： 阻断Wnt信号通路对多发性骨髓瘤骨病作用；方法： 收集30例诊断为多发性骨髓瘤患者和18例健康对照组的临床资料、血清；采用ELISA方法测定血清SDF-1，DKK-1水平；体外培养多发性骨髓瘤细胞株，分别加入35ng/ml SDF-1和100ng/mlDKK-1，通过 Western Blot 方法观察DKK-1的表达量；采用 SPSS Statistics 13. 0进行统计学分析。当P<0. 05时认为存在统计学差异。结果：MM患者（n=30）血清SDF-1水平显著高于健康对照（n=18） （（3724.5土 1586.8）pg/ml VS （3028.6±587.4）pg/ml， P =0.015）。MM 患者血清 DKK-1 水平亦显著高于健康对照[（3814.6土3487. 8）pg/ml VS （1881.3土657.8）pg/ml，P=0.029]。在体外培养MM细胞株，采用35ng/ml SDF-1作用于MM细胞和100ng/mlDKK-1作用于MM细胞，Western Blot结果：显示在SDF-1介导下，DKK-1的表达量较对照组及SDF-1组都有明显升高（P <0.005）。结论 SDF-1与DKK-1共同介导多发性骨髓瘤。

关键词：SDF-1 DKK-1 多发性骨髓瘤

基质细胞衍生因子（Stromal cell derived factor， SDF-1）是通过CXCR4受体调节成骨系统。SDF-1主要是由骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stroma cell，BMSC）分泌，而SDF-l具有促进破骨细胞（Osteoclast ， OC）活化及骨吸收作用。近年来SDF-l在骨髓瘤骨病中的作用逐漸受到关注，与其配体CXCR4趋化瘤细胞。但SDF-1/CXCR4对多发性骨髓瘤患者（multiple myeloma， MM）成骨作用的影响目前尚未见报道，在MM患者血清SDF-l与DKK1二者是否相互作用促进骨髓瘤骨病发生尚不明确。

一、材料和方法

1.材 料

收集2014年10月至2015年6月收集漯河市中心医院血液科多发性骨髓瘤病例，30例；收集2014年10月与漯河市中心医院体检中心进行健康体检，18例；细胞株：人多发性骨髓瘤细胞株，漯河医学高等专科学校科研中心储存。RPMI1640培养（ Gibcol），人淋巴细胞分离液（TBD），胰蛋白酶（Gibco公司），胎牛血清（ 四季青），兔抗actin（ 多克隆抗体， Abcom），兔抗DKK-1（ 多克隆抗体，Sigma），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG抗体（ 碧云天）。

2.方法

（1）血清分离 采集患者治疗前及治疗后或者复发及健康成人外周血各10mL，EDTA抗凝，3000rpmXl5min离心，取上清液。ELISA检测血清中SDF-1的含量。

（2）MM培养1640培养基中培养，2-3天换液，当细胞密度大于1XlO6/ml时，进行传代， 加入SDF-1剌激，将细胞分为两组，其一加入35ng/ml SDF-1，另一组加入100ng/ml DKK-1溶液，培养48h后收集细胞，提取蛋白。Western Blot检测DKK-1蛋白表达量。

（3）统计学处理：采用 SPSS13.0 软件进行方差分析 数据以均数±标准差（x±s）表示，P <0.05 说明差异有统计学意义。

二、结果

MM患者（n=30）血清SDF-1水平显著高于健康对照（n=18） （（3724.5土 1586.8）pg/ml VS （3028.6±587.4）pg/ml， P =0.015）。MM 患者血清 DKK-1 水平亦显著高于健康对照（（3814.6土3487. 8）pg/ml VS （1881.3土657.8）pg/ml，P=0.029）。在体外培养MM细胞株，采用35ng/ml SDF-1作用于MM细胞和100ng/mlDKK-1作用于MM细胞，Western Blot结果：显示在SDF-1介导下，DKK-1的表达量较对照组及SDF-1组都有明显升高（P <0.005）。

三、讨论

研究证明（组织形态学），MM患者的骨吸收增加的同时破骨细胞（OC）数量和活性也相应在增加。而肿瘤细胞与OC之间交流密切，相互促进，形成恶性循环[1]。研究表明，Wnt信号通路可以调节骨的代谢和维持骨质稳态[2]，DKK-1是Wnt信号通路的一种可溶性抑制剂[3]。DKK-1阻断剂可通过阻断Wnt信号通路而阻断成骨细胞分化进而调节成骨细胞。本实验首先比较了MM患者组与健康对照组中血清SDF-1水平，发现MM患者血清SDF-1 水平较对照组显著升高，具有统计学意义。

在MM疾病中，SDF-1和DKK-l的关联是一种特有情况。主要是表达在造血干细胞和淋巴细胞表面。SDF-lct对于破骨作用的增强已得到广泛认可[4]。其能够增加0C活力和骨吸收活性，破骨激活的相关基因包括RANK，RANKL，TRAP等表达增加。但在MM疾病状态中，本研究结合血清SDF-1和DKK-l的水平，为了进一步深层的解释SDF-1与DKK-1之间在蛋白之间的关系，及他们之间的相关性，体外培养MM细胞株，提取蛋白用Western Blot检测，研究结果显示，SDF-1可以促使DKK-1的表达上调（如图1），可推断，Wnt信号通路受到抑制，DKK-1对于破骨作用有增强的作用，也使成骨作用减弱，从而打破了骨吸收与骨形成的动态平衡。

为了进一步研究其机制，有研宄人员通过建立敲除CXCR4基因的小鼠模型，因而进一步证实SDF-1/CXCR4轴参与并介导成骨的分化，而且对以后发育骨豁起到了一个非常重要作用。本研宄创新性地发现SDF-l和DKK-1密切作用，DKK-1抑制剂目前已进入临床试验阶段。

参考文献

[1] Roodman GD. Pathogenesis of myeloma bone disease[J]. Blood cells，molecules & diseases， 2004， 32 （2） ：290 - 2.

[2] Hosogane N. Stromal derived factor-1 regulates bone morphogenetic protein 2-induced osteogenic differentiation of primary mesenchymal stem cells [J]. The international journal of biochemistry cell biology， 2010， 42（7）：1132 -41.

[3] Zhu W， Liang G， Huang Z， et al. Conditional inactivation of the CXCR12 receptor in osteoprecursors reduces postnatal bone formation due to impaired osteoblast development [J]. The Journal of biological chemistry ， 2011， 286（30）：26794 – 805.

[4] Zannettino ACff. Elevated serum levels of stromal-derived factor—lalpha are associated with increased osteoclast activity and osteolytic bone disease in multiple myeloma patients [J]. Cancer research， 2005， 65（5）：1700-9.endprint