响应面法优选骨碎补总黄酮的超声提取工艺

2017-09-12李景林立

福建中医药 2017年4期

关键词：面法黄酮乙醇

李景，林立

（福建医科大学孟超肝胆医院，福建福州350025）

响应面法优选骨碎补总黄酮的超声提取工艺

李景，林立

（福建医科大学孟超肝胆医院，福建福州350025）

目的优选骨碎补总黄酮的超声提取工艺。方法以总黄酮提取率为指标，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken中心组合设计，运用响应面法对影响总黄酮提取率的超声时间、提取温度、乙醇体积分数和料液比进行优化。结果最佳工艺为超声时间30 min、提取温度66℃、乙醇体积分数64%、料液比1∶92 g／mL。在此工艺条件下，骨碎补总黄酮提取率为4.86%，与理论值4.90%较为相近。结论优选的骨碎补总黄酮超声提取工艺稳定可行，为骨碎补总黄酮的开发利用提供实验依据。

骨碎补；总黄酮；超声提取工艺；响应面法

骨碎补是水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根茎，其性味苦、温，归肝、肾经，具有疗伤止痛、补肾强骨功效，临床主要用于跌扑闪挫，筋骨折伤，肾虚腰痛，筋骨痿软，耳鸣耳聋，牙齿松动等症。其主要活性成分是以柚皮苷为主的总黄酮，用于治疗骨质疏松症，能明显抑制骨质疏松症导致的骨密度下降，在抑制破骨细胞活性的同时，促进成骨细胞增殖［1-2］。目前骨碎补总黄酮多采用正交设计试验提取［3-6］，关于响应面法优选骨碎补总黄酮超声提取工艺尚未见报道。响应面分析法能找出各因素的最佳组合和响应最优值，最终找出最优工艺参数，有效地解决多变量问题，在中药学研究领域已得到很好的应用［7-8］。本实验以总黄酮提取率为指标，采用响应面法优选骨碎补总黄酮的提取工艺，为该有效成分开发利用提供理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器UV-9600紫外可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器有限责任公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；DF-15连续投料粉碎机（大德中药机械有限公司）。

1.2 试药骨碎补饮片购自福州九州通大药房，经福建医科大学孟超肝胆医院药学部刘志芳副主任中药师鉴定为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根茎；柚皮苷（上海源叶生物科技有限公司，批号：20120221）；甲醇、乙醇均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制参照文献［9］，取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇配成质量浓度分别为378 μg／mL的对照品溶液，即得。精密吸取柚皮苷对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以甲醇为空白，于283 nm处测定吸光度（Y），以吸光度（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，得回归方程：

Y＝0.039X＋0.011r＝0.999 5，

柚皮苷在6.05～24.19 μg／mL内线性关系良好。

2.2 骨碎补总黄酮的提取及含量测定取骨碎补粗粉约0.25 g，精密称定，置锥形瓶中；加入规定量不同体积分数乙醇溶液，在规定温度下超声提取规定时间，离心，精密吸取提取液2.5 mL于蒸发皿中，水浴蒸干；残渣用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。按2.1项下方法进行测定，计算总黄酮得率。

2.3 单因素试验考察分别考察超声时间、提取温度、乙醇体积分数、料液比等因素对总黄酮提取率的影响，结果显示：超声提取时间30 min、提取温度约65℃、乙醇体积分数为60%、料液比1∶90时，总黄酮提取率较大，见图1。

2.4 响应面优化实验在单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken实验设计原理，选取超声时间（A）、提取温度（B）、乙醇体积分数（C）和料液比（D）为考察因素，以骨碎补总黄酮得率为响应值，建立四因素三水平共29个实验，因素水平及编码见表1，实验设计结果见表2。

2.5 建立模型方程与显著性检验在综合单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取超声时间（A）、提取温度（B）、乙醇体积分数（C）和料液比（D）为考察因素，以骨碎补总黄酮得率为响应值，应用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到A、B、C、D与骨碎补总黄酮提取率（T）的二次多项回归方程：

对拟合方程进行方差分析，结果见表3。由表3分析可知：方程模型F值为39.89，P＜0.000 1，具有非常显著性；失拟项F值为3.65，P＝0.111 7＞0.05，失拟度不显著；R2＝0.975 5，说明方程拟合度好，试验误差小，可以用该模型对试验结果进行分析预测。各实验因素与响应面值的关系不是简单的线性关系，其中C、AD、BC、A2、B2、C2、D2对骨碎补总黄酮提取率影响非常显著，A为高度显著，D为显著，其他不显著，各因素对指标的影响大小顺序为C＞A＞D＞B。

图1 超声时间、提取温度、乙醇体积分数及料液比对总黄酮提取率的影响

表1 响应面分析因素水平及编码

表2 响应面分析试验设计及结果

表3 回归模型的方差分析

2.6 响应面图分析各因素间交互作用对骨碎补总黄酮提取率的影响，见图2。可看出超声时间（A）和料液比（D）交互影响非常显著，表现为曲面陡峭，响应值变化较大，等高线为椭圆形；提取温度（B）和乙醇体积分数（C）的交互作用影响次之；其他因素交互作用的影响均不显著。

2.7 验证实验由Design-Expert 8.0.6软件分析，得到最佳的提取工艺为：超声时间29.53 min、提取温度66.30℃、乙醇体积分数64.31%、料液比1∶91.71，骨碎补总黄酮提取率理论值为4.90%。为方便实际操作，将提取工艺修正为：超声时间30 min、提取温度66℃、乙醇体积分数64%、料液比1∶92，根据此条件，进行3次平行验证实验，骨碎补总黄酮实际提取率分别为4.84%、4.91%、4.82%，平均值为4.86%，RSD为0.97%，与理论值相对误差为0.81%，表明该提取工艺稳定可行，具有实用价值。

3 讨论

在前期实验中，考察了不同溶剂（甲醇、乙醇）和不同提取次数对总黄酮提取率的影响，结果表明不同溶剂提取率没有显著差别，而且提取次数增多，提取率略有增加但变化不大，故从工业化生产以及经济效益方面考虑，最后确定以乙醇为提取溶剂，提取2次。

在单因素试验中，对超声时间进行考察，从图1A可知，在提取时间10～30 min时，总黄酮提取率随时间延长而升高，但超过30 min时，总黄酮提取率随时间增加而降低，原因可能是由于提取时间过长，乙醇挥发增多，总黄酮溶出减少；同时超声时间太长，使骨碎补黄酮类化合物结构被破坏，从而导致提取率减少。对料液比进行考察，从图1D可知，在1∶50～1∶90，随着料液比的增加，总黄酮提取率呈上升趋势，当超过1∶90时，总黄酮提取率下降，分析其可能由于料液比增大，杂质的溶解也同时增多，反而使总黄酮提取率下降。

本实验在单因素试验结果基础上，采用Box-Behnken试验设计以及响应面分析法对骨碎补总黄酮的超声提取工艺进行优选，得出最佳工艺条件为：超声时间30 min、提取温度66℃、乙醇体积分数64%、料液比1∶92。在此工艺条件下，总黄酮提取率可达4.86%。该实验结果对骨碎补总黄酮的提取研究有一定的参考价值，为骨碎补的资源开发提供实验依据。