应用噬菌体生物扩增法对HIV/TB双重感染患者抗结核药耐药性分析研究

何茂锐,向明确△,罗 谊,廖 兵,万荣珍,龙泉鑫,陈作芬，邱 嫒

(1.重庆市第九人民医院感染科 400700；2.重庆市第九人民医院检验科 400700；3.重庆医科大学 400016)

应用噬菌体生物扩增法对HIV/TB双重感染患者抗结核药耐药性分析研究

何茂锐1,向明确1△,罗 谊2,廖 兵2,万荣珍1,龙泉鑫3,陈作芬1，邱 嫒1

(1.重庆市第九人民医院感染科 400700；2.重庆市第九人民医院检验科 400700；3.重庆医科大学 400016)

目的 利用噬菌体生物扩增法(PhaB)分析人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核病(TB)双重感染患者的结核分枝杆菌的耐药状况，优化防治对策。方法 运用PhaB法对重庆市第九人民医院收治的112例HIV/TB双重感染患者(HIV/TB组)做TB菌的药敏检测，并与208例单纯肺结核患者(单纯TB组)的药敏检测做对比分析。结果 HIV/TB组的抗TB药耐药率要比单纯TB组低，HIV/TB双重感染患者5种常见抗TB药物的耐药率分别为异烟肼(INH)7.14%、吡嗪酰胺(PZA)7.14%、利福平(RFP)5.36%、链霉素(SM)5.36%、乙胺丁醇(EMB)4.46%，与单纯TB组患者比较(RFP 17.31%、INH 13.46%、PZA 11.54%、EMB 10.58%、SM 9.62%)，HIV/TB组RFP的耐药率低于单纯TB组，差异有统计学意义(P<0.05)，其他4种抗TB药耐药率与单纯TB组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与绝对浓度法结果符合率分别为INH 96.4%、RFP 98.2%、PZA 96.4%、EMB 93.8%和SM 96.4%。结论 本地区HIV/TB双重感染患者结核分枝杆菌对RFP耐药率较普通肺结核患者低，与该类患者良好的服药依从性相关。PhaB测定所需时间短，操作简便，不需特殊仪器设备，可作为结核分枝杆菌耐药性的快速筛选方法。

分枝杆菌噬菌体；获得性免疫缺陷综合征；结核；双重感染；耐药

我国是一个结核病(tuberculosis,TB)高发国家，严重威胁人民生命健康，而TB又是HIV/AIDS较常见和先发生的机会性感染。我国TB病疫情的卷土重来，其中一个重要的原因就是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的流行，TB病加重人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的病程发展，AIDS的流行促进了TB菌的传播，因此，HIV和TB的双重感染被认为是一种致死性的结合模式，已经成为我国公共卫生的重大问题[1-2]。同时耐药结核分枝杆菌株特别是耐多药结核分枝杆菌[至少同时耐异烟肼(INH)和利福平(RFP)]的逐渐增多使得TB的全球传播变得更加难以防控。大多数学者认为,结核分枝杆菌快速检测、耐药性筛查及新型抗结核药物的研发是TB病防治的关键。然而，常规耐药性检测方法耗时过久，严重影响临床治疗的实际需要；快速培养测定系统虽然可明显减少时间，但仍需4～8 d，且仪器设备及检测试剂昂贵；分子生物学检测技术虽然准确、灵敏，但操作复杂、对操作者技术要求高，临床推广应用较困难。而近年来逐渐开展的噬菌体生物扩增法(PhaB)具备操作简单、快速，不需特殊仪器设备、对环境污染较小等优点，2～3 d即可获得结果，又有较高的敏感度和特异度，非常适合我国中小医院及基层医疗机构推广应用。

本研究采用PhaB法检测HIV/TB双重感染患者痰标本的结核分枝杆菌对常见抗结核药物耐药状况，为防止该类患者耐药结核分枝杆菌的发生及临床治疗优化提供实验依据，现将重庆市第九人民医院2011-2015年收治的112例HIV/TB双重感染患者痰标本所做的结核分枝杆菌耐药检测与同期208例TB患者的痰标本TB耐药检测做对比分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 重庆市第九人民医院2011-2015年门诊和住院收治的HIV/TB双重感染患者112例，其中男89例，女23例，年龄平均39.2岁(17～72岁)；普通TB患者208例，其中男152例，女56例，平均年龄45.6岁(19～75岁)。患者主要来自重庆市北碚区、合川区、渝北区、四川省广安市等地区。

1.2 试剂 无淀粉改良罗氏培养基购于青岛海博生物科技有限公司。INH、RFP、吡嗪酰胺(PZA)购于上海信宜药厂。链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)购于西南药业公司。Middlebrook 7H9培养基购于BD公司。耻垢分枝杆菌(ATCC607)购于国家菌种保藏中心。硫酸亚铁胺购于Sigma公司。分枝杆菌噬菌体D29由上海肺科医院赠送。

1.3 研究对象分组方案

1.3.1 入组患者按我国AIDS防治指南(2005版)及肺结核诊疗指南(2013版)制订的诊断标准纳入，并按试验要求分组如下：HIV/TB组(痰涂片阳性)112例；单纯TB组(痰涂片阳性)208例。

1.3.2 抗结核药物耐药分类标准 初始性耐药：既往未进行过抗结核治疗或接受抗结核治疗不满1个月发生的抗药物耐药。获得性耐药：既往进行抗结核治疗1个月以上发生的抗结核药物耐药。多重耐药：同一标本出现2种或2种以上抗结核药物耐药。

1.4 检测方法

1.4.1 PhaB法 取0.1 mL噬菌体与待检菌液混匀作用约1 h，然后加入 0.1 mL杀毒剂，混匀，室温作用约10 min，再加入5 mL改良罗氏培养基和1 mL指示细胞，混匀后与等量熔化琼脂混合浇注平板，冷却、成形后置 37 ℃培养18～24 h，最后观察平板有无出现噬菌斑并计数。每次检测均设噬菌体对照、杀毒剂对照、阴性及阳性对照。结果观察：肉眼观察，数出平板上的噬菌斑，同一平板上的噬菌斑数至少经过2人确认。耐药性判断：计算每个菌株的加药管与对照管的噬菌斑减少率(加药管噬菌斑个数/对照管噬菌斑个数×100%)，敏感为噬菌斑减少率大于或等于95%，反之为耐药。

1.4.2 绝对浓度法 参照中国防痨协会制订的操作规程[2],用pH值约为5．5的改良罗氏固体培养基，进行常规细菌的绝对浓度法5种抗结核药物耐药性检测，药物终浓度分别为INH 1 μg/mL，RFP 50 μg/mL，PZA 100 μg/mL，EMB 5 μg/mL，SM 10 μg/mL。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0软件对所有检验结果进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PhaB检测5种抗结核药耐药性结果 HIV/TB组与单纯TB组5种抗结核药的耐药率：HIV/TB耐药率分别为INH 7.14%、PZA 7.14%、RFP 5.36%、SM 5.36%、EMB 4.46%。单纯TB组耐药分别为RFP 17.31%、INH 13.46%、PZA 11.54%、EMB 10.58%、SM9.62%。其中RFP的耐药率低于单纯TB组，差异有统计学意义(P<0．05)，其余4种抗结核药耐药率与单纯TB组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 TB/HIV和单纯TB的耐药率比较

表2 TB/HIV和单纯TB患者的初始、获得、多重及总耐药率比较[n/n(%)]

表3 208例单纯TB患者PhaB法与绝对浓度法5种抗结核药物耐药性检测结果比较

表4 112例HIV/TB患者PhaB法与绝对浓度法5种抗结核药耐药性检测结果比较

2.2 2组患者初始、获得与总耐药率 HIV/TB组初始耐药率为22.99%，获得耐药率为28.00%，多重耐药率为3.57%，总耐药率为24.11%；单纯TB组初始耐药率、获得耐药率、多重耐药率、总耐药率分别为29.63%、46.58%、19.71%、35.58%。两组比较其中多重耐药率、总耐药率差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 PhaB检测单纯TB组患者5种抗结核药物耐药性结果和绝对浓度法检测结果对比 分别用PhaB法和绝对浓度法检测208份单纯TB患者痰标本5种抗结核药物耐药性。以绝对浓度法检测结果为检测标准，则PhaB法对5种抗结核药耐药性检测的敏感度、特异度和准确率分别为：INH 92.9%、99.4%、98.6%，RFP 91.7%、99.4%、98.1%，PZA 79.2%、97.8%、95.7%，EMB 90.9%、97.3%、96.6%、SM，78.9%、97.4%、95.6%，提示PhaB法检测结果和经典的绝对浓度法高度一致，见表3。

2.4 PhaB检测HIV/TB组患者5种抗结核药物耐药性结果和绝对浓度法检测结果对比 分别用PhaB法和绝对浓度法检测112份HIV/TB患者痰标本5种抗结核药耐药性。以绝对浓度法检测结果为判断标准。则PhaB法对5种抗结核药耐药性检测的敏感度、特异度和准确率分别为INH 71.4%、98.1%、96.4%，RFP 83.3%。99.1%。98.2%，PZA 57.1%、99%、96.4%，EMB 60%、95.3%、93.8%，SM 66.7%、98.1%、96.4%，见表4。

3 讨 论

目前我国TB发病人数仅次于印度居世界的第2位，疫情十分严峻。同时随着AIDS在我国的逐渐流行，该类患者细胞免疫功能低，HIV病毒破坏机体的CD4+T淋巴细胞及巨噬细胞的正常免疫功能，可导致感染者发生内源或外源性的TB菌感染，从而导致AIDS合并TB患者逐渐增多，有研究显示，HIV感染可使TB的发病率增加30倍[3]。反之，结核分枝杆菌感染可激活CD4+T淋巴细胞，为HIV病毒复制提供更多宿主细胞，加速AIDS病情进展。因此，AIDS的流行已成为我国TB死灰复燃的主要原因。国内外有学者调查显示HIV/TB感染者对抗结核药物的耐药性高于HIV阴性者，其中以RFP和INH最为突出,Yoshiyama等[4]于1996-1998年的25个月期间在泰国北部的ChiangRai省，Haar等[5]于1993-2001年间在荷兰调查HIV/TB的耐药情况，结果发现HIV阳性患者TB获得性耐药发病率高于HIV阴性者。郑献民[6]对河南省某AIDS高发地区HIV感染合并耐多药肺结核的成因进行调查，结果显于24例HIV(+)合并耐多药患者均为获得性耐多药。而本研究显示本地区TB/HIV双重感染者结核分枝杆菌对INH、RFP、SM、PZA、EMB耐药率比单纯TB患者低，且其中对RFP的耐药率差异有统计学意义(P<0.05)。本研究还显示HIV/TB双重感染者多重耐药率、总耐药率也低于单纯TB患者，差异有统计学意义(P<0.05)。因此本研究结果考虑与如下因素有关：(1)与依从性的教育差别有关：笔者在TB/HIV双重感染者初次就诊时即重视服药依从性教育，绝大多数TB/HIV双重感染者服药依从性可达到90%以上，良好的服药依从性是TB/HIV双重感染者耐药率降低的主要原因，而单纯TB患者因对疾病本身重视不足等原因导致服药依从性较差，提示要降低普通TB患者的耐药率需要加强对患者的依从性教育。(2)HIV感染者出现肺外TB可能性较高，有学者统计其发生率达54．8%[7]，如果肺外TB按普通TB治疗，常因为疗程不足导致复发，进而诱导耐药的发生，而TB/HIV双重感染者往往抗结核治疗疗程足，因此耐药率较低。(3)早期诊断的重要性：本院对于TB或HIV患者均进行HIV和结核的筛查，这样对于无明显症状的HIV/TB患者可早期诊断，尽早治疗，从而减少耐药的发生。(4)AIDS规范化治疗对TB治疗的影响：目前，我国对AIDS患者进行免费HARRT治疗，要求患者在专科医生指导下规律用药，全程监管，这对于合并TB的患者进行抗TB治疗亦有一定作用。因此，对于TB/HIV双重感染者，应在有经验的医务人员按照抗结核治疗用药原则即早期、联合、适量、规律、全程指导下进行治疗，整个治疗期间重视依从性教育，减少耐药性的产生。

PhaB是一种操作简单、费用低廉、快速地检测结核耐药的新方法，与常规结核耐药性检测结果符合率高，目前认为这是一种极具发展前景的新方法[8]。其基本原理是：对于生长缓慢的结核分枝杆菌和快速生长的耻垢分枝杆菌，分枝杆菌噬菌体D29均能感染。当抗结核药物与结核杆菌作用一定时间后，敏感株因被抗结核药物杀死，而耐药菌能继续生长，并被随后加入的噬菌体所感染，随后加入杀毒剂杀死未能感染结核分枝杆菌的噬菌体。而进入菌体内的噬菌体不受影响，从而在菌体内大量繁殖，并将结核分枝杆菌裂解，释放出的噬菌体可立即感染随后加入的耻垢分枝杆菌(指示菌)并使其裂解，由于指示菌繁殖迅速，所以24h观察到在培养皿上会出现明显噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无及数量的多少即可判断待检菌株的耐药性[9]。目前，国内尚未见用该方法对HIV/TB双重感染者进行耐药性检测研究的报道。本研究显示：PhaB法具有较高的敏感度、特异度，与Sharma等[10]研究结果相符。本研究结果与常规绝对浓度法比较，所需的时间仅为3 d，大大快于常规检测方法，且成本较低，操作简单。由于条件限制，本研究未对两种方法结果不符的标本进行最低抑菌浓度(MIC)和基因芯片方法检测。同时该方法可简便、快速获得药敏试验结果[11]，能基本满足临床诊治要求，肉眼即可观察结果，不需特殊仪器设备，成本低廉，便于在中小医院及基层医疗机构推广应用[12]。对及时筛查耐药的肺结核患者有重要的临床应用价值。此外，利用该法进行检测中耐药菌株被完全裂解，不易造成院内感染和环境污染，对耐药结核分枝杆菌预防和控制极为有利。

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Study on antimicrobial resistance of anti-tuberculosis drugs in patients with double infection of HIV/TB using phage bio-amplification method

HeMaorui1,XiangMingque1△,LuoYi2,LiaoBing2,WanRongzhen1,LongQuanxin3,ChenZuofen1,QiuYuan1

(1.DepartmentofInfection，ChongqingNinthPeople′sHospital,Chongqing400700,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ChongqingNinthPeople′sHosptial,Chongqing400700,China;3.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To analyze the drug resistance status of mycobacterium tuberculosis in patients with double immunization of human immunodeficiency virus (HIV) and tuberculosis (TB) by phage bioassay (PhaB),and to optimize the control strategy.Methods One hundred and twelve cases of HIV/TB infected patients in Chongqing Ninth People ′s Hospital were treated with PhaB method,and the drug susceptibility testing results were compared with 208 cases of simple pulmonary tuberculosis patients.Results The anti-tuberculosis drug resistance rate of HIV/TB patients was lower than that of simple pulmonary tuberculosis patients.The resistance rates of 5 common anti-tuberculosis drugs in HIV/TB patients were 7.14% of isoniazid (INH),7.14% of pyrazinamide (PZA),5.36% of rifampicin(RFP)streptomycin(SM),and 4.46% of ethambutol (EMB),compared with simple pulmonary tuberculosis(resistance rates of RFP were 17.31%,INH 13.46%,PZA 11.54%,EMB 10.58%,SM 9.62%),RFP resistance rate of HIV/TB infected patients was lower(P<0.05).There was no significant difference between two groups in the other four anti-tuberculosis drug(P>0.05).The coincidence rate with the absolute concentration method were INH 96.4%,RFP 98.2%,PZA 96.4%,EMB 93.8% and SM 96.4%,respectively.Conclusion The resistance rate of mycobacterium tuberculosis to RFP in patients with HIV/TB infection in this region is lower than that in patients with common pulmonary tuberculosis,which is related to the good medication compliance of these patients.PhaB has the characteristic of fast,simple,without special equipment,it can be used as a rapid screening of mycobacterium tuberculosis drug resistance method.

mycobacterium tuberculosis;acquired immunodeficiency syndrome;tuberculosis;double infection;drug resistance

重庆市卫生局资助项目(渝卫科技2011-2-398)。

何茂锐(1979-) ，副主任医师，主要从事艾滋病防治研究。

△通信作者，E-mail:mqxiang@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.016

R516

A

1671-8348(2017)23-3219-03

2017-02-02

2017-03-23)

论著·临床研究