假单胞菌基因敲除方法研究进展

熊 烈，钱淑岚，朱成云，李 骏，钟卫鸿

(浙江工业大学生物工程学院，浙江 杭州 310032)

假单胞菌基因敲除方法研究进展

熊 烈，钱淑岚，朱成云，李 骏，钟卫鸿*

(浙江工业大学生物工程学院，浙江 杭州 310032)

基因敲除是近年来十分热门的基因工程技术，假单胞菌(Pseudomonas)作为一种常见细菌，应用十分广泛，因此，对假单胞菌进行基因敲除改造有着十分重要的意义。总结了假单胞菌基因敲除技术成功案例，并对2种基因敲除系统进行了比较，包括同源重组关键步骤的转化方式、基因敲除方法的选择、同源臂长度的选择等。

假单胞菌；基因敲除；同源重组

基因敲除又称基因打靶，是指外源打靶基因与基因组目标基因通过基因工程手段，在转染细胞中发生DNA同源重组，使外源基因定点整合到基因组目标基因中[1]。基于该技术，可实现诸如插入突变、缺失突变等多种形式的突变。

假单胞菌(Pseudomonas)是一类重要的微生物，分布十分广泛，在土壤、水体以及生物体中都可见。假单胞菌为革兰氏阴性菌；细胞呈单个，多为直或弯的杆菌，大小为(0.5～1.0)μm×(1.4～4.0)μm，单鞭毛或多鞭毛；大多数假单胞菌的最适生长温度在30 ℃左右，生长pH值在7.0～8.5之间[2]。由于假单胞菌在环境修复、生物防治、生物转化等领域都有着广泛的应用[3]，因此对假单胞菌进行基因工程改造，尤其是基因敲除意义重大。为此，作者总结了假单胞菌基因敲除技术成功案例，并对2种基因敲除系统进行了比较，包括同源重组关键步骤的转化方式、基因敲除方法的选择、同源臂长度的选择等，以期为假单胞菌基因敲除的深入研究提供参考。

1 非自身同源重组的基因敲除系统

Red同源重组又称ET重组，最初应用于大肠杆菌中，可实现对细菌染色体基因的定点敲除。Murphy[4]在1998年首次利用λ噬菌体Red同源重组系统对大肠杆菌进行了基因修饰。

在细菌内，自然发生的同源重组效率极低，大约在10-6左右，而一般的转染技术的转化效率大概在104～105·(μgDNA)-1左右[5]。Red同源重组不依赖于宿主菌本身的重组系统，而是将λ噬菌体中编码Exo、Beta、Gam3种蛋白质的基因克隆至载体中，再将携带同源臂与筛选标记的打靶片段导入宿主菌，利用载体在宿主菌中表达相应蛋白，实现同源重组。其中，exo基因编码的Exo蛋白具有λ核酸外切酶活性，与双链DNA末端相结合，从5′端向3′端降解DNA单链，产生3′突出末端[6]；bet基因编码的Beta蛋白与在Exo蛋白作用下产生突出末端的DNA分子结合，保护其不被降解且介导互补链的退火，同时兼有重组酶活性催化同源重组[7-8]；gam基因编码的Gam蛋白的分子量在16 000Da左右，可以与宿主RecBCD核酸外切酶结合，并抑制其活性，以防止外源DNA进入细菌后被宿主降解[9-10]。因此，Red同源重组可大大提高细菌同源重组效率。

1.1 依赖打靶片段的Red同源重组系统

依赖打靶片段的Red同源重组系统：将来源于λ噬菌体中的exo、bet、gam基因克隆至载体质粒上，并使其受诱导性启动子调控，常用的启动子有阿拉伯糖启动子与间甲基苯甲酸启动子等；再通过PCR得到携带有一定长度靶基因的上下游同源臂的标记基因片段；将标记基因片段转化入经诱导的宿主菌中；最后通过相应的筛选可得到突变菌株。如图1所示。

图1 依赖打靶片段的Red同源重组系统示意图

该方法的重组效率与同源臂长度密切相关，在E.coli中使用该方法只需几十bp的同源臂即可完成敲除，而对于假单胞菌要用数百bp至1 000 bp的同源臂来提高同源重组的效率，但也有使用较短同源臂成功敲除的案例。余华等[11]将exo、bet、gam基因与阿拉伯糖启动子相连，并克隆至质粒pUCP中，分别利用含有80 bp和400 bp同源臂的打靶片段在Pseudomonasaeruginosa中成功实现了基因敲除，使用较短同源臂时重组子正确概率在80%左右，而使用较长同源臂时正确概率几乎达到100%。杨运文等[12]将exo、bet、gam基因与间甲基苯甲酸启动子连接，并克隆至质粒pJB866中，利用含有500 bp同源臂的打靶片段在Pseudomonasputida中成功实现了基因敲除，重组效率达到5×10-5，重组子正确概率达到60%以上。

1.2 依赖双质粒的Red同源重组系统

在基因敲除过程中，标记基因往往选择的是抗生素抗性基因，使得在实际应用过程中会遇到许多问题，如水平转移至其它细菌中会造成耐药性、对环境存在一定威胁等。因此，需要将标记基因从基因组中敲除。

依赖双质粒的Red同源重组系统：在依赖外源打靶片段的Red同源重组的基础上，将loxP位点插入标记基因与同源臂之间，然后由exo、bet、gam基因的表达蛋白共同介导第一次同源重组，重组后的菌株再导入可诱导表达Cre酶的质粒，经诱导后可由Cre介导第二次同源重组，敲除标记基因与1个loxP位点。如图2所示。

由于该方法操作较依赖打靶片段的Red同源重组系统复杂，故使用该方法的报道案例较少。Luo等[13]构建了含有间甲基苯甲酸启动子诱导的exo、bet、gam基因的质粒pLS2352以及含有鼠李糖诱导的cre重组酶基因的质粒pLS1678；用500 bp左右的同源臂对PseudomonasputidaKT2440的多个基因完成了敲除，并且实现了标记基因的敲除，重组子正确概率几乎达到100%。但是该方法会在基因组中留下1个loxP位点，若想在突变株的基础上继续进行基因敲除，则可能会受到一定影响。

图2 Cre介导的第二次同源重组示意图

2 依赖自身同源重组的基因敲除系统

依赖自身同源重组的基因敲除系统，通常使用在假单胞菌中不可复制的质粒携带靶基因上下游同源臂序列或靶基因内的一段序列进行同源重组，利用其在假单胞菌中自杀的特性，只有当质粒整合到基因组中时才能获得质粒上的筛选标记，从而得到重组子[14-15]。

2.1 一轮同源重组的插入突变

一轮同源重组基因敲除的原理：在假单胞菌的自杀载体中携带有一段截短的目标基因序列，导入目标菌株后，由于该载体在目标菌株中自杀的特性，若未发生同源重组将质粒整合入基因组，其筛选标记无法表达，整合入基因组后筛选标记得以表达，从而实现插入突变。如图3所示。

图3 一轮同源重组基因敲除原理

虽然该方法只需发生一轮同源重组就可实现基因的插入突变，成功率较高，操作也较简单；但是该方法无法实现无缝敲除，相比于Red同源重组系统所引入的外源片段也较长，可能以破坏靶基因上下游基因阅读框结构的方式导致不必要的突变。因而，该方法通常用于以基因功能验证为目的的基因敲除[16]。

一轮同源重组常用的自杀质粒有pK18mob、pCVD442、pEX18Tc等。其中，pK18mob是利用在假单胞菌中无法识别的复制子来实现自杀的；pCVD442实现自杀的原理是其复制子依赖于π蛋白，而一般的菌株中不表达π蛋白。Tang等[17]将361 bp的序列酶切连接至自杀质粒pK18mob中，利用一轮同源重组对PseudomonasputidaS16成功实现了hpo基因的敲除。张加勤等[18]利用自杀质粒pEX18Tc，将缺失部分序列的靶基因及上下游同源臂连接入载体质粒，对PseudomonasaeruginosaPAO1的clpP基因进行了敲除。

2.2 两轮同源重组的无缝敲除

两轮同源重组与一轮同源重组类似，也是利用自身同源重组系统实现基因敲除，其原理是：将目标基因上下游片段连接后克隆至自杀载体中，导入目标菌株后分别通过正筛选标记和反筛选标记得到发生2次同源重组且基因敲除的菌株。如图4所示。

图4 两轮同源重组基因敲除原理

两轮同源重组常用载体质粒有pK18mobsacB、pEX18Tc等。相较于一轮同源重组，两轮同源重组需要发生2次同源重组且有一定恢复成野生型的概率，操作繁琐，成功率较低；但是可以实现无缝敲除，不会对目标基因上下游基因造成影响[15]。Wang等[19]利用自杀质粒pEX18Tc携带700 bp左右的上下游同源臂对PseudomonasmendocinaNK-01成功进行了基因敲除。Liu等[20]利用质粒pK18mobsacB携带800 bp左右的上下游同源臂对PseudomonaschlororaphisGP72的lon基因成功进行了敲除。

3 2种基因敲除系统的比较(表1)

表1 2种基因敲除系统的比较

Tab.1 Comparison of two gene knockout systems

从表1可看出，操作最简单的是一轮同源重组系统，但是该方法会将大量片段整合入基因组；操作最复杂的是依赖双质粒的Red同源重组系统，但是该方法会将loxP位点遗留在基因组中。

3.1 同源重组关键步骤的转化方式

在利用同源重组系统进行假单胞菌基因敲除的过程中，由于假单胞菌的特殊性，大多数假单胞菌可分泌胞外多糖从而保护细胞免受外界有害物质的作用[21]，而这种多糖可能会阻碍Ca2+与细胞膜的作用，导致热激效率下降。有学者针对多种假单胞菌的Ca2+感受态与热激进行过优化，在最优条件下转化效率也只能达到105·(μg DNA)-1左右[5]，这对于常规质粒的转化是足够了的，但对于依赖同源重组而实现的基因敲除是远远不够的。

依赖exo、bet、gam基因的同源重组效率在10-5左右，而依赖细菌自身的同源重组效率只有10-6左右，这对转化效率提出了更高的要求，故一般在进行同源重组这一关键步骤时，研究者们大多使用电转化(electroporation)方式或是接合转移(conjugation)方式来实现转化。近两年来，国内外数十篇关于假单胞菌基因敲除的报道中，在同源重组这一关键步骤中使用的转化方法如图5所示。

图5 同源重组关键步骤转化方式的报道数量

从图5可以看出，在同源重组关键步骤中，接合转移方式被更多的研究者所采用，供体菌大多使用E.coliS17-1λ-pir与E.coliWM3064，占所有供体菌的40%左右，且这2株菌都可以表达π蛋白，相比于E.coliS17-1λ-pir，E.coliWM3064是一株2,6-二氨基庚二酸(2,6-DAP)营养缺陷型菌株，在筛选时更为有利。相比于电转化，接合转移不需要制备特定的感受态，也不需要特殊的仪器，更容易扩大菌体量，这也许是更多研究者采用接合转移方式的原因所在。

3.2 基因敲除方法的选择

若将假单胞菌基因敲除方法分为非自身同源重组的基因敲除和依赖自身同源重组的基因敲除，那么，对国内外数十篇关于假单胞菌基因敲除方法的分类如图6所示。

图6 基因敲除方法的报道数量

从图6可以看出，常规的非自身同源重组基因敲除方法远远少于依赖自身同源重组基因敲除方法。虽然从理论上看，非自身同源重组基因敲除的重组效率与重组子正确概率都较高，但使用该方法的研究者并不多，这可能是由于非自身同源重组基因敲除需要制作至少2次感受态细胞，对载体质粒的构建也更复杂，实验流程更长；更重要的可能是，由于假单胞菌与E.coli菌种之间的特异性和假单胞菌属内不同种之间的特异性，使得exo、bet、gam基因的表达及蛋白功能等都会受到一定的影响，从而进一步降低同源重组的效率。

3.3 同源臂长度的选择

在基因敲除过程中，同源重组效率不仅取决于转化效率，其同源臂长度也起着十分关键的作用。在国内外数十篇关于假单胞菌基因敲除的报道中，其同源臂长度的分类如图7所示。

从图7可以看出，研究者更多地选择较长同源臂，这也从另一个侧面证实了同源臂长度在基因敲除过程中起到了十分关键的作用。在所有统计的论文中，同源臂最长的达到约4 000 bp[22]，最短的仅160 bp[11]。

图7 同源臂长度的报道数量

4 结语

在生物技术日益发展的今天，基因敲除技术也逐渐变得简单易行，而假单胞菌作为一种分布广泛的细菌，在环境修复、生物防治、生物转化等领域有着十分重要的作用[3]。通过大量的假单胞菌基因敲除技术成功案例的比较，建议使用依赖自身同源重组基因敲除方法，根据实验目的选择一轮同源重组或两轮同源重组进行基因敲除，同源臂长度选择1 000～2 000 bp为宜，并采用接合转移方式进行转化。

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Research Progress of Gene Knockout inPseudomonas

XIONG Lie,QIAN Shu-lan,ZHU Cheng-yun,LI Jun,ZHONG Wei-hong*

(CollegeofBiologicalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032,China)

Geneknockoutisaverypopulargeneticengineeringtechnologyinrecentyears.Pseudomonasisacommonbacterium,whichisappliedverywidely.Therefore,geneknockoutinPseudomonasisverysignificant.WereviewthesuccessfulcaseofgeneknockoutinPseudomonas,andcomparetwokindsofgeneknockoutsystemsinthefollowingaspects:transformationmethodofkeystepinhomologousrecombination,choiceofgeneknockoutmethod,andchoiceofthelengthofhomologousarm,etc.

Pseudomonas;geneknockout;homologousrecombination

国家自然科学基金项目(31670115)

2017-03-23

熊烈(1992-)，男，浙江桐乡人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail:357534323@qq.com；通讯作者：钟卫鸿，教授，博士生导师，E-mail:whzhong@zjut.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.002

Q819

A

1672-5425(2017)08-0005-05

熊烈，钱淑岚，朱成云，等.假单胞菌基因敲除方法研究进展[J].化学与生物工程，2017，34(8)：5-9.