氮素形态对烟草黑胫病发生的影响

谭 军，周冀衡*，李 强，张 毅，陈丽鹃，周路阔,2，邓利平

（1.湖南农业大学烟草研究院，湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128； 2.湖南省烟草公司郴州市公司，湖南 郴州 423000；3.郴州市桂阳县烟草公司，湖南 桂阳 424400）

氮素形态对烟草黑胫病发生的影响

谭 军1，周冀衡1*，李 强1，张 毅1，陈丽鹃1，周路阔1,2，邓利平3

（1.湖南农业大学烟草研究院，湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128； 2.湖南省烟草公司郴州市公司，湖南 郴州 423000；3.郴州市桂阳县烟草公司，湖南 桂阳 424400）

为寻找控制烟草黑胫病发生的有效措施，研究了硝态氮、铵态氮及其配比液对烟草黑胫病菌孢子萌发、菌丝生长以及烟株次生代谢物和抗病性的影响。结果表明，硝态氮、铵态氮及其混合液均可以加速烟草黑胫病游动孢子的萌发，二者混合溶液更有利于黑胫病菌丝的生长。随着溶液中铵态氮浓度的升高，烟株根系木质素、纤维素和MDA含量以及SOD、POD、PAL活性显著升高，增强了烟株的抗病性，从而使其发病率和病情指数显著下降。相关性分析表明，烟株黑胫病发病率和病情指数与其根系木质素、MDA含量和SOD、POD、PAL活性均极显著负相关，黑胫病发病率与纤维素含量显著负相关。因此，烟株黑胫病发病率和病情指数与其次生代谢物密切相关，铵态氮可以显著降低烟草黑胫病发病率和病情指数，但硝态氮和铵态氮最适配比及田间抗病效果还需进行大量相关田间试验研究。

烟草黑胫病；氮素形态；发病率

烟草黑胫病是由黑胫病病菌引起的一种土传性病害，是烟草毁灭性病害之一，在烟草整个生育期均可发病，给我国乃至全世界烟草种植造成了巨大损失[1-2]。氮肥是植物生长发育不可或缺的营养元素。硝态氮和铵态氮是农业生产中主要施用的氮肥形态。不同氮素形态能影响作物生长发育和根系形态结构，影响作物抗病性[3]。研究表明铵硝配施能增强杭白菊抗菊花斑枯病的能力[4]，硝态氮单施可以增强大白菜[5]、香蕉[6]等作物的抗病性。不同氮素形态也能影响病原菌生长繁殖及其致病性。研究表明硝态氮可以抑制番茄镰刀菌萎蔫病、玉米细菌性枯萎病，铵态氮可以抑制西瓜、甜瓜根腐病[7]。氮肥形态与病原菌和作物抗病性有密切关系[8-9]。目前，烟草种植上对黑胫病防治主要以培育抗病性品种[10-12]和施用化学药剂为主[13]，以轮作[14]等栽培措施为辅，但从氮肥形态角度研究其对烟草黑胫病生长繁殖和烟株抗病性影响的还鲜见报道。因此，本论文研究了不同氮素形态及其配比对烟草黑胫病游动孢子萌发、菌丝生长以及烟苗抗病性的影响，以期为烟草黑胫病的防治和氮肥的合理施用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

绿色荧光蛋白标记的烟草黑胫病菌由西北农林科技大学单卫星教授惠赠，烟草品种为K326，10% V8培养基。

1.2 氮素形态对烟草黑胫病游动孢子萌发的影响

设置5个不同氮素配比处理，即NO3−∶NH4+分别为10∶0、7∶3、5∶5、3∶7、0∶10，NO3−由Ca(NO3)2提供，NH4+由(NH4)2SO4提供，总氮浓度为10 mmol/L，用CaCl2补充铵态氮处理中缺少的Ca元素，使各处理Ca含量相等。配好后置于121 ℃下灭菌20 min。参照郑小波[15]的方法制备烟草黑胫病游动孢子，并调整其浓度为1×104mL。参照文献[16]取灭菌的凹面载玻片，向其凹穴中滴加灭菌氮素溶液15 μL，并加等量游动孢子悬浮液。以等量无菌水代替氮营养液作对照。每个处理3次重复。于28 ℃黑暗保湿培养，每隔2小时取样用荧光显微镜（奥林巴斯IX71）观察其萌发情况。

1.3 氮素形态对烟草黑胫病菌丝生长的影响

将不同配比的氮素溶液分别添加到V8培养基中配制成含氮量为5 mmol/L的10% V8琼脂培养基，高压灭菌后倒入平板。用直径为5 mm的灭菌打孔器在活化7 d长满黑胫病菌丝的平板上取菌饼，然后用接种针将其分别挑取到平板中心，每个培养皿1个菌饼，3次重复。以添加等量无菌水代替氮营养液作对照。置于28 ℃培养箱中黑暗培养。每24小时采用“十字交叉法”测量菌落直径。

1.4 氮素形态对烟苗黑胫病菌发生情况及其生理特征的影响

采用1.2的方法配制总氮浓度为5 mmol/L，其他营养元素与Hoagland配方相同的营养液。试验在湖南农业大学烟草研究院温室中进行，光照强度15 000 Lux，光照周期为12 h/12 h，温度26～28 ℃（光照）/18～20 ℃（黑暗），湿度70%～80%。采用常规漂浮育苗方法育苗，待其长至4叶1心时，选取长势一致的烟苗洗去基质后置于71 cm×46 cm×18 cm的塑料盆中，用自制带孔的聚氯乙烯泡沫板固定烟苗。每盆50株，每个处理6盆，共计300株。并先用1/2浓度的Hoagland营养液预培养5 d，再分别置于总氮浓度为5 mmol/L的不同氮素形态配比的营养液中培养7 d，然后从各处理中分别随机挑选3盆，置于浓度为1×107mL的黑胫病游动孢子悬浮液中浸根24 h，以在无菌水中浸根相同时间作为对照处理。营养液每5天更换1次。每2天用1 mol/L NaOH调节营养液pH使之维持在6.8～7.0。接菌后继续处理10 d，然后统计烟苗病害情况，并取烟苗根部测定生理指标。根据GB/T 23222—2008标准统计病害情况[17]。按照下列公式计算发病率和病情指数。发病率(%)=发病植株/植株总数×100 %；病情指数=∑(各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100。木质素含量测定采用溴乙酰方法[18]，纤维素含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性参照文献[19]测定，SOD活性和POD活性分别采用NBT（氮蓝四唑）法和愈创木酚法测定[20]，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定[20]。

1.5 数据分析

应用Excel 2013和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。文中的数据均为（平均值±标准误差）格式。

2 结 果

2.1 氮素形态对烟草黑胫病游动孢子萌发的影响

由表1可知，在6 h和8 h各处理组的孢子萌发率均极显著高于对照组（p=0.000）。当处理超过8 h，各处理组与对照组的孢子萌发率差距缩小，到12 h无显著差异（p=0.520）。此外，硝态氮、铵态氮混合处理的孢子萌发率总体高于其单独处理，但未达到统计学上的显著差异。因此，硝态氮和铵态氮可以加速烟草黑胫病游动孢子的萌发，但对孢子的最终萌发率无显著影响。

2.2 氮素形态对烟草黑胫病菌丝生长的影响

由表2可知，与对照相比，硝态氮和铵态氮单独处理对烟草黑胫病菌丝生长均无显著促进作用，但二者混合溶液总体有利于菌丝的生长，方差分析表明，差异达到显著水平。因此，硝态氮和铵态氮混合溶液有利于烟草黑胫病菌丝的生长。

表1 不同氮素形态及配比对烟草黑胫病游动孢子萌发的影响Table 1 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the germination of tobacco black shank zoospores

表2 不同氮素形态及配比对烟草黑胫病菌丝生长的影响Table 2 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the mycelial growth of tobacco black shank

2.3 氮素形态对烟苗黑胫病发病率及病情指数的影响

由表3可知，随着溶液中铵态氮浓度增加，烟苗黑胫病发病率和病情指数都极显著下降（p=0.000）。全硝态氮处理的烟苗发病率和病情指数分别是全铵态氮处理的2.09倍和2.05倍。当溶液中NO3−∶NH4+由10∶0到7∶3时，烟苗发病率 下降幅度最大，达20.67%。因此，硝态氮和铵态氮不同配比对烟草黑胫病发病率和病情指数都有极显著影响。

表3 不同氮素形态及配比对烟苗黑胫病发病 情况的影响Table 3 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the occurrence of tobacco black shank at seedling stage

2.4 氮素形态对烟苗根系生理指标的影响

由图1可知，烟苗根系木质素含量随培养液中铵态氮比例增加而显著升高。木质素含量增幅最大是由10∶0到7∶3时，增加了2.37倍， 其次是NO3−∶NH4+由3∶7到0∶10时，增加了1.88倍。纤维素含量随培养液中铵态氮比例增加先升高后降低，当溶液NO3−∶NH4+由10∶0到7∶3时，其含量显著升高；当溶液NO3−∶NH4+由3∶7到0∶10时，其含量显著下降。因此，氮素形态对烟苗根系木质素和纤维素含量有显著影响。

由图2可知，烟苗根系SOD和POD活性均随培养液中铵态氮比例增加而显著升高。当溶液NO3−∶NH4+由10∶0到7∶3时，SOD和POD活性均显著升高；NO3−∶NH4+由5∶5到3∶7时，两者活性均极显著升高；NO3−∶NH4+由7∶3到5∶5时，两者活性均无显著变化。因此，氮素形态及配比对烟苗根系SOD和POD活性有显著影响。

图1 不同氮素形态及配比对烟苗根系木质素、 纤维素含量的影响Fig. 1 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the contents of lignin and cellulose of tobacco seedling roots

图2 不同氮素形态及配比对烟苗根系SOD和 POD活性的影响Fig. 2 Effects of different nitrogen forms and their ratios on SOD and POD activity of tobacco seedling roots

由图3可见，PAL活性和MDA含量均随培养液中铵态氮比例增加而显著升高。当溶液NO3−∶NH4+由10∶0到7∶3时，PAL活性极显著升高，MDA含量显著升高；NO3−∶NH4+由7∶3到5∶5时，PAL活性显著提高，MDA含量无显著变化；NO3−∶NH4+由5∶5到0∶10时，PAL活性和MDA含量均极显著升高。因此，氮素形态及配比对烟苗根系PAL活性和MDA含量有显著影响。

图3 不同氮素形态及配比对烟苗根系PAL活性和 MDA含量的影响Fig. 3 Effects of different nitrogen forms and their ratios on PAL activities and MDA content of tobacco seedling roots

2.5 烟苗生理指标与黑胫病发病率和病情指数的相关分析

上述研究表明，随着溶液NO3−∶NH4+由10∶0到0∶10，烟苗黑胫病发病率和病情指数均显著下降，而根系木质素、纤维素含量、SOD活性等生理指标均显著升高，为了深入研究他们之间的关系，对其进行相关性分析，结果如表4所示。烟苗发病率和病情指数与烟苗根系木质素含量、SOD活性、POD活性、PAL活性和MDA含量均极显著负相关（p＜0.01），烟苗发病率与纤维素含量显著负相关（p=0.046）。

表4 生理指标与黑胫病发病率和病情指数的相关分析Table 4 Correlation analysis of physiological indicators with disease incidence and disease index

3 讨 论

氮素是植物、微生物生长繁殖必需的营养元素，亦被称为“生命元素”。已有大量研究表明，氮肥形态与致病菌及作物抗病性有密切关系[6-8,10-11]。本研究表明，硝态氮、铵态氮及其不同配比虽不显著影响游动孢子最终萌发率，但均可以加速其萌发；两者混合溶液更有利于黑胫病菌丝生长；铵态氮可以提高烟苗抗病性，从而显著降低烟草黑胫病发病率和病情指数。前人报道铵态氮可以降低草莓黑腐病发病率和番茄尖孢镰刀菌致病力[21]，硝态氮可以降低香蕉枯萎病[6]和大白菜斑点病的发生[5]。由此可知，氮素形态对不同病原菌致病力的影响存在较大差异。这可能是因为不同病菌体内与氮代谢相关的途径存在较大差异。前人研究表明，高浓度铵态氮对烟草有毒害胁迫[22]。植物在长期进化过程中形成了一套完善抵御各种胁迫的防御机制。SOD、POD等保护酶系在植物抵御胁迫中起着重要作用。当由胁迫诱导产生的活性氧超出保护酶清除能力时就会导致细胞内脂膜系统被氧化，使得MDA含量升高[23]。本研究表明，全硝态氮处理时烟苗根系中的SOD、POD活性、MDA含量都最低，表明此时细胞中活性氧含量最低，细胞膜系统受损害程度也最轻。当NO3−∶NH4+由10∶0到5∶5时，SOD、POD活性和MDA含量虽有增加，但较为平缓，表明此时SOD、POD等保护酶将细胞内活性氧维持在较低水平，细胞膜系统受损害程度较轻。当NO3−∶NH4+由5∶5到0∶10时，SOD、POD活性和MDA含量增加剧烈，表明此时细胞内积累了大量的活性氧，保护酶活性虽然增加，但仍未能将其及时清理，最终导致细胞膜系统受损。

烟苗根系木质素、纤维素含量和PAL活性随着培养液中铵态氮浓度升高而升高。相关分析表明，烟苗发病率和病情指数与烟苗根系木质素、MDA含量以及SOD、POD、PAL活性均呈极显著负相关。木质素是酚类聚合物，主要存在于细胞壁纤维素形成的网状结构中。木质素含量增加可以增加细胞壁的厚度，增强纤维素间的胶黏作用，能有效阻止病原菌对作物的侵染[24]。所以木质素的增加可以提高作物抵御病害侵染和增强抗逆性的能力。本研究结果与前人研究的木质素含量增加可以增强黄瓜[25]、猕猴桃[26]、杭白菊抗病性[4]的结果基本一致。PAL酶是植物细胞内酚类化合物合成的关键酶，其活性增强可以有效提高酚类物质的含量。酚类物质除其本身是抗菌物质外，也是木质素合成的前提物质，所以其变化趋势与木质素基本一致。该研究结果与前人研究结果一致[27]。POD既直接参与细胞内活性氧的清除，又可以将酚类化合物氧化成醌类化合物，参与植保素、木质素等物质的生物合成[28]。所以POD活性与烟苗发病率和病情指数呈负相关。

本试验结果表明，铵态氮可以显著降低烟草黑胫病的发病率和病情指数。因此在烟草育苗及种植过程中可以通过合理施用铵态氮肥来提高烟草抗黑胫病的能力。但考虑到高浓度的铵态氮对烟苗生长发育和烟叶品质有负面影响[29-30]。所以二者最佳配比以及田间施用效果还需开展大量相关田间试验进一步研究。

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Effects of Nitrogen Forms on the Occurrence of Tobacco Black Shank

TAN Jun1, ZHOU Jiheng1*, LI Qiang1, ZHANG Yi1, CHEN Lijuan1, ZHOU Lukuo1,2, DENG Liping3

(1. Institute of Tobacco, College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. Chenzhou Tobacco Company, Chenzhou, Hunan 423000, China; 3. Guiyang Branch of Chenzhou Tobacco Company, Guiyang, Hunan 424400, China)

In order to find effective measures to control tobacco black shank, effects of nitrate, ammonium and their different ratios on spore germination and mycelial growth of tobacco black shank as well as the secondary metabolism and disease resistance of tobacco were studied. The results showed that the germination of zoospores of tobacco black shank was accelerated by nitrate, ammonium and their mixed solutions, and the mycelia of tobacco black shank grew better in their mixed solutions. With the increasing of ammonium concentration in solutions, the contents of lignin, cellulose and MDA and the activities of SOD, POD and PAL in tobacco roots increased significantly, while the incidence and the disease index of tobacco black shank decreased significantly. The correlation analysis showed that there was a extremely significantly negative correlation between the incidence/disease index of tobacco black shank and the contents of lignin and MDA and the activities of SOD, POD and PAL(p＜0.01), and there was a remarkable negative correlation between the incidence of tobacco black shank and the content of cellulose. So the results revealed that the incidence and the disease index of tobacco black shank are closely related to the secondary metabolites, which can be significantly reduced by ammonium application. However, a large number of field trials need to be carried out to study the optimal ratio of nitrate and ammonium nitrogen under field conditions.

tobacco black shank; nitrogen forms; incidence

S435.72

1007-5119（2017）04-0080-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.04.013

湖南省烟草公司郴州市公司项目“水旱两段式育苗技术研究与应用”（2016009）

谭 军（1985-），男，在读博士，主要从事烟草生理生化研究。E-mail：649766283@qq.com。*通信作者，E-mail：jhzhou2006@163.com

2017-02-15

2017-03-11