大蒜素对慢性肾衰大鼠肾组织细胞凋亡的抑制作用与机制研究*

杨雅楠

（河北省廊坊市第四人民医院，河北 廊坊 065700）

大蒜素对慢性肾衰大鼠肾组织细胞凋亡的抑制作用与机制研究*

杨雅楠

（河北省廊坊市第四人民医院，河北 廊坊 065700）

目的 观察大蒜素对慢性肾衰（CRF）大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响并初探其机制。方法 100只实验用大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］组，采用腺嘌呤溶液［250 mg/（kg·d）］灌胃21 d的方法建立CRF大鼠模型，大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］组腹腔注射给药治疗，疗程28 d。测定24 h尿量、24 h尿蛋白量及血清肾功能指标（BUN、SCr、UA含量），H&E染色法观察肾脏组织病理变化；TUNEL染色法观察肾脏组织细胞凋亡状况，Western blotting法检测Bcl-2、Bax、NF-кB表达并进行半定量分析，化学比色法检测肾脏组织抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量。结果 与模型对照组比较，大蒜素10、20 mg/（kg·d）组24 h尿量显著减少，24 h尿蛋白量显著降低（P<0.05或P<0.01），血清BUN、SCr、UA含量显著降低（P< 0.05或P<0.01）；经大蒜素治疗28 d能够明显改善CRF大鼠肾脏组织病变及细胞凋亡状况，大蒜素10、20 mg/（kg·d）组凋亡指数（AI）显著降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表达显著上调、Bax显著下调且Bcl-2/Bax表达比值显著升高（P<0.05或P<0.01），NF-κB表达显著下调（P<0.05或P<0.01），抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）］活性显著升高且MDA含量显著降低（P<0.05或P<0.01），其中大蒜素20 mg/（kg·d）组过氧化氢酶（CAT）活性显著升高（P<0.05）。结论 大蒜素可能通过抑制肾脏组织细胞凋亡而对CRF大鼠起到一定的保护作用，可能与其调节凋亡相关蛋白表达及抑制氧化应激损伤有关。

大蒜素 慢性肾衰 肾脏组织 细胞凋亡 NF-κB

大蒜素是一种具有抗氧化、抗凋亡、抑制炎症反应等多种生物学活性的二烯丙基三硫化物［1-2］，既往研究发现大蒜素通过抑制细胞凋亡而对糖尿病肾病和肾缺血再灌注损伤均具有一定的保护作用［3-4］，但大蒜素是否对CRF大鼠肾脏组织细胞凋亡是否具有抑制作用尚未见文献报道。本研究通过制备CRF大鼠模型并给予大蒜素进行干预治疗，观察大蒜素对CRF大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响，并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，清洁级，雄性，体质量180～220 g，河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 试药与仪器 大蒜素注射液（黑龙江江世药业有限公司，规格：2 mL∶30 mg）；H＆E、TUNEL试剂盒和SOD、CAT、MDA试剂盒 （北京博奥森生物技术有限公司）；BUN、SCr、UA试剂盒 （深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；Bcl-2、Bax、NF-κB多克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；腺嘌呤（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 分组与造模 100只实验用大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、大蒜素（5、10、20 mg/kg）组，每组20只。参照杜卉莲等［5］研究报道的实验方法制备CRF大鼠模型：25%腺嘌呤溶液［250 mg/（kg·d）］连续灌胃21 d制备CRF大鼠模型，正常对照组正常饮食与饮水。

1.4 给药方法 造模完成后，大蒜素组按5、10、20mg/（kg·d）腹腔注射治疗大蒜素，正常对照组与模型对照组腹腔注射0.9%氯化钠注射液，疗程28 d。

1.5 标本采集与检测 1）收集24 h尿量并通过生化分析仪测定24 h尿蛋白量。2）血清肾功能指标检测：腹主动脉取血（不做抗凝处理），离心取血清，通过生化分析仪测定血清BUN、SCr、UA含量。3）肾脏组织病变和细胞凋亡的观察：取称量后左侧肾脏置于4%多聚甲醛溶液固定72 h，然后行石蜡包埋、切片、展片和脱蜡水化处理，行常规HE染色后通过倒置光学显微镜观察肾脏组织形态结构变化；行TUNEL染色观察肾脏细胞凋亡状况，每张图片随机选取互不重叠的5个视野并分别计数细胞总数和凋亡细胞数，然后计算凋亡指数（AI），AI（%）＝（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。4）Western blotting法检测凋亡相关蛋白：取右侧肾脏组织，加入适量冷裂解液后行研磨匀浆，离心（12000 r/min，10 min）取上清液，沸水浴5 min行蛋白变性，行电泳、转膜、丽春红染色、5%脱脂奶粉封闭2 h后，一抗（1∶500）Bcl-2、Bax、NF-κB、β-actin恒温4℃过夜；洗膜3次后二抗（1∶100）室温震荡孵育1 h后经ECL显色；然后以β-actin为内参，以条带灰度值半定量分析脑组织Bcl-2、Bax、NF-κB表达并计算Bax/Bcl-2比值。5）肾脏组织抗氧化酶活性和MDA含量测定：取右侧肾脏、加入适量冷裂解液行研磨匀浆，离心（3000 r/min，10 min）取上清液，按试剂盒说明通过化学比色法测定肾脏组织SOD、CAT活性和MDA含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间两两比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量的比较 见表1。与正常对照组比较，模型对照组大鼠24 h尿量显著增加，24 h尿蛋白量显著升高（P<0.01）。经大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治疗28 d能够显著降低CRF大鼠24 h尿量和24 h尿蛋白量（P<0.05或P<0.01）。

表1 各组大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量、体质量、肾脏指数比较（±s）

表1 各组大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量、体质量、肾脏指数比较（±s）

与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

24 h尿量（mL）24 h尿蛋白量（mg） 体质量（g） 肾脏指数（×10-3）10.50±2.80 5.40±1.60 311.50±34.20 3.90±0.60 38.70±6.90**36.10±7.80**208.30±31.70**17.30±2.10**35.60±7.10 32.00±7.40 215.40±28.60 15.80±1.90大蒜素10 mg/（kg·d）组 20 31.40±5.80△18.40±4.90△△223.50±29.00 13.20±1.60△△大蒜素20 mg/（kg·d）组 20 27.20±5.30△△11.50±3.30△△241.70±28.20△10.30±1.20△△组别 n正常对照组 20模型对照组 20大蒜素5 mg/（kg·d）组 20

2.2 各组大鼠体质量、肾脏指数的比较 见表1。与正常对照组比较，模型对照组大鼠体质量和肾脏指数均显著升高（P<0.01）；经大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治疗28 d能够显著升高体质量（P<0.05），显著降低肾脏指数（P<0.01）。

2.3 各组大鼠血清肾功能指标的比较 见表2。与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清肾功能监测指标（BUN、SCr、UA含量）显著升高（P<0.01）；经大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治疗28 d能够显著降低各肾功能监测指标（P<0.05或P<0.01）。

表2 各组大鼠血清肾功能监测指标比较（±s）

表2 各组大鼠血清肾功能监测指标比较（±s）

组别 n正常对照组 20模型对照组 20大蒜素5 mg/（kg·d）组 20 BUN（mmol/L）SCr（μmol/L） UA（mmol/L）5.90±1.40 70.20±9.30 65.70±9.80 24.40±3.80**136.10±35.00**113.20±17.50**19.70±4.20 127.30±36.80 99.10±23.00大蒜素10 mg/（kg·d）组 20 14.50±2.90△△115.70±27.40△83.60±16.40大蒜素20 mg/（kg·d）组 20 11.60±2.50△△106.50±24.30△78.20±13.90△

2.4 各组大鼠肾脏组织病变的比较 见图1。观察各组大鼠肾脏HE染色病理切片：正常对照组大鼠肾小球、肾小管及间质区组织结构和细胞形态均未见异常；模型对照组呈现肾小球变性、数量减少、球囊粘连、囊腔和管腔扩大，肾小管内结晶、坏死出可见大量炎症细胞和少量中性粒细胞浸润；与模型对照组比较，经大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］治疗28 d能够明显改善CRF大鼠肾脏组织病变，以20 mg/（kg·d）组最为显著。

图1 各组大鼠肾脏组织病变（HE染色，400倍）

2.5 各组大鼠肾脏组织细胞凋亡情况比较 见图2。观察各组大鼠肾脏TUNEL染色切片：正常对照组大鼠肾脏组织凋亡细胞检出率极低；模型对照组凋亡细胞数量较正常对照组明显增多，肾小管和肾小球均有凋亡细胞检出；经5、10、20 mg/（kg·d）大蒜素治疗28 d能够明显减少CRF大鼠凋亡细胞数量，以20 mg/（kg·d）组最为显著。比较各组细胞AI，模型对照组AI［（67.4± 19.3）%］较正常对照组AI［（3.2±1.4）%］显著升高（P< 0.01），大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］组AI分别为（53.6± 17.5）%、（33.4±10.8）%、（17.2±5.3）%，其中大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］组AI较模型对照组显著降低（P<0.01）。

图2 各组大鼠肾脏组织细胞凋亡（TUNEL，400倍）

2.6 各组大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax、NF-κB表达的比较 见图3，表3。与正常对照组比较，模型对照组大鼠Bcl-2、Bax、NF-κB表达表达显著上调 （P<0.05或P< 0.01）；经大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治疗28 d能够显著上调CRF大鼠肾脏组织Bcl-2表达并下调Bax、NF-κB表达（P<0.05或P<0.01），提高Bax/bcl-2比值（P<0.01）。

图3 各组大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax、NF-κB表达（Western blotting）

表3 各组大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax、NF-κB表达比较（±s）

组别 n正常对照组 20模型对照组 20大蒜素5 mg/（kg·d）组 20 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax NF-κB 0.27±0.08 0.18±0.06 1.50±0.30 0.11±0.04 0.42±0.09*0.76±0.28**0.60±0.20 0.53±0.17**0.46±0.13 0.63±0.22 0.80±0.30 0.46±0.20大蒜素10 mg/（kg·d）组 20 0.57±0.19△0.45±0.17△△1.30±0.40△△0.40±0.15△大蒜素20 mg/（kg·d）组 20 0.72±0.26△△0.28±0.13△△2.60±0.90△△0.27±0.08△△

2.7 各组大鼠肾脏组织抗氧化酶活性和MDA含量的比较 见表4。与正常对照组比较，模型对照组大鼠抗氧化酶活性显著降低且MDA含量显著升高（P<0.01）；经大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治疗28 d能够显著升高CRF大鼠SOD活性并降低MDA含量（P<0.05或P<0.01），经20 mg/（kg·d）治疗能够显著升高CAT活性（P<0.01）。

表4 各组大鼠肾脏组织抗氧化酶活性和MDA含量比较（±s）

组别 n正常对照组 20模型对照组 20大蒜素5 mg/（kg·d）组 20 SOD（U/mg）CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）13.10±1.80 2.50±0.60 4.60±1.10 6.40±1.00**1.20±0.40**15.20±2.30**7.10±1.30 1.50±0.30 13.00±2.70大蒜素10 mg/（kg·d）组 20 8.90±1.50△1.60±0.40 8.10±1.60△△大蒜素20 mg/（kg·d）组 20 11.20±1.60△△1.90±0.60△△6.30±1.20△△

3 讨 论

CRF是各种肾脏疾病（CKD）终末期的共同表现，病程不可逆且进行性加重［6］，目前尚无法治愈，临床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治疗措施以缓解CRF症状并延缓病情发展［7-8］，因此CRF一直是医药研究者关注的热点与难点。近年来，病理生理学研究发现继发性肾组织细胞凋亡是CRF病情进展的重要病理通路［9］。

大蒜素是一种具有抗凋亡等多种生物学活性的二烯丙基三硫化物［1-2］。本研究发现大蒜素治疗28 d能够有效减少CRF大鼠排尿量并降低尿蛋白量，降低血清BUN、SCr、UA含量，抑制CRF大鼠肾脏组织病变，提示大蒜素对CRF大鼠肾脏具有一定的保护作用。

细胞凋亡是一种由多种基因参与调控的细胞程序化死亡过程，其中B细胞淋巴瘤/Bcl-2为抑凋亡基因，而Bcl-2相关Bax为促凋亡基因，二者间相互作用、共同参与调控细胞凋亡过程［10］；Bcl-2不仅对线粒体损伤具有直接的保护作用，还间接抑制促凋亡调控蛋白Caspase-3激活［11］、抑制Bax细胞毒性作用，从而表现出对细胞凋亡的抑制作用［12］；Bax能够破坏线粒体渗透性而导致细胞色素C释放增加、激活Caspase-9，表现出对细胞凋亡的促进作用；因此Bax/Bcl-2值更加能够体现 Bax和 Bcl-2对细胞凋亡的调控作用［13］。NF-κB是一种多效能核转录因子。Zhang Q等［14］研究发现，活化的NF-κB能够促进巨噬细胞活化和浸润，诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡；但是常态下NF-κB存于细胞质中且无活性，当NF-κB受到氧自由基（ROS）攻击时，NF-κB将被活化并暴露出核定位信号而进入胞核内，促进基因转录并诱导细胞凋亡；此外，活化的NF-κB蛋白还能够促进巨噬细胞活化和浸润、诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡。机体组织抗氧化酶活性降低是导致氧自由基（ROS）过剩的主要原因，肾脏组织超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）含量丰富，是清除ROS而抑制氧化应激损伤的重要屏障［15］。韩海燕等研究发现抗氧化酶活性降低将导致ROS蓄积而引发脂质过氧化损伤，MDA含量升高［16］。本研究发现，大蒜素治疗28 d能够有效改善CRF大鼠肾脏组织凋亡状况，能够显著上调肾脏组织Bcl-2表达、下调Bax表达而显著提高Bcl-2/Bax表达比值，显著降低NF-κB表达，明显改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤。

综上所述，大蒜素能够有效改善CRF大鼠肾功能、抑制肾脏组织病变、抑制细胞凋亡、上调Bcl-2表达、下调Bax和NF-κB表达、提高Bcl-2/Bax表达比值、改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤，提示大蒜素可能通过抑制细胞凋亡而对CRF大鼠起到一定的保护作用，其机制可能与大蒜素能够调节凋亡相关蛋白表达及抑制氧化应激损伤有关。

［1］郭芳，邹方文，符婉，等.大蒜素对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究［J］.湖南师范大学学报：医学版，2012，9（2）：12-19.

［2］ 任丽丽，吴迪，李清君，等.大蒜素对全脑缺血/再灌注诱导的海马神经元凋亡的影响［J］.中国应用生理学杂志，2007，23（4）：402-429.

［3］ 黄虹，江缨，袁放，等.大蒜素对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用的实验研究［J］.浙江医学，2016，38（19）：1557-1560.

［4］ 吴建伟，罗春丽，李家彬，等.大蒜素及缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及机制研究［J］.重庆医科大学学报，2010，35（4）：549-552.

［5］ 杜卉莲，傅晓晴.慢性肾衰动物的模型制备及临床应用［J］.中医研究，2005，18（12）：53-57.

［6］ 吴鑫洪，丁国明，韩颖敏.肾衰宁联合包醛氧淀粉治疗慢性肾功能衰竭的临床疗效观察［J］.求医问药，2011，9（9）：260-261.

［7］ 冯青，万毅刚，蒋春明，等.中药延缓肾功能衰竭进展的机制和效果［J］.中国中药杂志，2011，36（9）：1122-1128.

［8］ 王磊.血液透析治疗慢性肾功能衰竭的临床疗效观察［J］.中国实用医药，2011，6（25）：52-53.

［9］ 杜鹃，王琼书，贾汝汉.慢性肾衰大鼠肾小球细胞增殖凋亡的研究［J］.实用医学杂志，2005，21（15）：1623-1625.

［10］张彦清，刘保江，田首元.丙泊酚对大鼠离体缺血/再灌注心肌细胞凋亡和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2011，9（1）：55-57.

［11］Kim JH，Choi JS.Effect of ginsenoside Rh-2 via activation of Caspase-3 and Bcl-2-insensitive pathway in ovarian cancer cells［J］.Physiol Res，2016，65（6）：1031-1037.

［12］Ogura T，Tanaka Y，Tamaki H，et al.Docetaxel induces Bcl-2-and pro-apoptosis caspase-independent death of human prostate cancer DU145 cells［J］.Int J Oncol，2016，48（6）：2330-2338.

［13］Saeedi Borujeni MJ，Hami J，Haghir H，et al.Evaluation of Bax and Bcl-2 proteins expression in the rat hippocampus due to childhood febrile seizure［J］.Iran J Child Neurol，2016，10（1）：53-60.

［14］Zhang Q，Huang WD，Lv XY，et al.Ghrelin protects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling［J］.Eur J Pharmacol，2011，654（2）：142-149.

［15］Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase：the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme［J］.J Virol，2014，2588（14）：254-261.

［16］韩海燕，路建饶，王新华，等.肾衰方对5/6肾切除大鼠的氧化应激和微炎症的作用与机制［J］.时珍国医国药，2015，26（10）：2391-2394.

Inhibitory Effect and Mechanism of Allicin on Apoptosis of Renal Tissue in Rats with Chronic Renal Failure

YANG Yanan.The Fourth People′s Hospital of Langfang，Hebei，Langfang 065700，China.

Objective：To study the effect of allicin on the apoptosis of renal tissue in chronic renal failure（CRF）rats and to explore its mechanism.Methods：100 rats were randomly divided into the normal control group，the model control group and allicin［5，10，20 mg/（kg·d）］groups.The CRF rat model was established by intragastric administration with adenine solution［250 mg/（kg·d）］for 21 days，and then intraperitoneal injection of allicin［5，10，20 mg/（kg·d）］for 28 d.24 h urine volume，24 h urinary protein volume and serum renal function indexes（BUN，SCr and UA）were measured.Pathological changes of kidney were observed by H&E staining，and the apoptosis of renal tissue was observed by TUNEL staining.Western blotting was used to detect the expression of Bcl-2，Bax and NF-кB.Semi-quantitative analysis was carried out，and the activities of antioxidant enzymes and malondialdehyde（MDA）in kidney tissues were detected by chemical colorimetry.Results：Compared with the model group，the 24 h urine output and 24 h urinary protein in allicin［10，20 mg/（kg·d）］groups reduced significantly（P<0.05 or P<0.01）；the content of BUN，SCr，UA in serum reduced significantly（P<0.05 or P< 0.01）.Allicin treatment for 28 days could obviously improve the pathological changes and apoptosis of kidney tissue in CRF rats.The poptosis index（AI）decreased significantly in allicin［10，20 mg/（kg·d）］groups（P<0.01）；the expression of Bcl-2 increased significantly；the expression of Bax decreased significantly and the Bcl-2/Bax increased significantly（P<0.05 or P<0.01）；the expression of NF-кB decreased significantly（P<0.05 or P< 0.01）；the activities of antioxidant enzymes（SOD）increased significantly in the kidney tissues and the content of MDA decreased significantly（P<0.05 or P<0.01），and the activities of catalase（CAT）increased significantly in 20 mg/kg·d group（P<0.05）.Conclusion：Allicin may play a protective role in CRF rats by inhibiting the apoptosis of renal tissue，which may be related to regulating the expression of apoptosis related proteins and inhibitingoxidative stress damage.

Allicin；Chronic renal failure；Renal tissue；Apoptosis；NF-κB

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1364-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.015

2017-04-23）

河北省廊坊市科技支撑计划项目（2016013136）