青柏溃结汤对溃疡性结肠炎大鼠疗效的研究*

张 林吴洁琼张 伟张锋利史 英林俊超

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000）

青柏溃结汤对溃疡性结肠炎大鼠疗效的研究*

张 林1吴洁琼2△张 伟2张锋利2史 英2林俊超1

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000）

目的 观察青柏溃结汤对乙酸诱导溃疡性结肠炎大鼠模型结肠黏膜愈合及血清细胞因子的影响并探讨其机制。方法 将77只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、青柏溃结汤高剂量组、青柏溃结汤中剂量组、青柏溃结汤低剂量组、柳氮磺吡啶组、康复新液组，各11只，除空白组外其余各组采用乙酸造模。造模后第3开始灌肠给药，连续7 d，随后观察各组结肠组织并评分。用ELISA检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）含量。结果 与模型组比较，各治疗组血清TNF-α含量下降、IL-10含量升高。结论 青柏溃结汤能明显减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠组织的损伤程度，这可能与其下调TNF-α、上调IL-10的水平有关。

青柏溃结汤 溃疡性结肠炎 TNF-α IL-10

溃疡性结肠炎（UC）病情反复迁延、难以根治［1-2］。长期反复发作可诱发癌变，严重影响患者的生活质量［3-4］。笔者在临床上采用青柏溃结汤保留灌肠治疗UC取得了较好疗效。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD雄性大鼠77只，体质量220～250 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（陕）2012-003。

1.2 实验药物 青柏溃结汤（药用黄柏9 g，苦参20 g，大青叶12 g，板兰根20 g，乌贼骨25 g，炒薏苡仁30 g，由陕西中医药大学第二附属医院药剂科熬制完成，所得水煎液每毫升含2 g生药，中、低剂量青柏溃结汤由高剂量青柏溃结汤稀释而来），柳氮磺吡啶（上海信谊天平药业有限公司），康复新液（湖南科伦制药有限公司，批号M160918）。

1.3 试剂与仪器 水合氯醛 （上海山浦化工有限公司），溶于0.9%氯化钠注射液配成10%的混合液。冰乙酸（天津市天力化学试剂有限公司），溶于0.9%氯化钠注射液配成8%的混合液。水合氯醛TNF-α、IL-10试剂盒（上海桥杜生物科技有限公司，批号RA20040，RA20095）。RT-6100酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司），GREEN-30T实验室级高纯水器（南京易普易达科技发展有限公司制造），S.HH.W21.600-S水浴箱（上海跃进医疗器械有限公司）

1.4 模型制备 大鼠禁食不禁水24 h后用10%的水合氯醛（3 mL/kg）进行腹腔注射麻醉，8%乙酸1 mL注入距肛门7 cm处的结肠腔，灌注30 s，然后用5 mL生理盐水冲洗1次，而后常规饲养。

1.5 分组与给药 将健康雄性SD大鼠正常饲养1周后，随机分为即空白组等体积。0.9%氯化钠注射液、模型组（等体积0.9%氯化钠注射液）、青柏溃结汤高剂量组（2 g/mL）、青柏溃结汤中剂量组（1 mg/L）、青柏溃结汤低剂量组（0.5 g/mL）、柳氮磺吡啶组（0.5 g/kg）、康复新液组（5 mL/kg），除空白组以外，其余各组按上述方法复制UC模型。造模后第3日每组随机取2只做病检以确定造型成功，然后开始灌肠给药，每日1次，连续7 d。

1.6 标本采集与检测 1）结肠组织形态学变化。取出距离肛门2 cm以上8 cm处的结肠段，将其表面清理干净并纵向剪开肠腔，预冷0.9%氯化钠注射液反复冲洗直至干净，滤纸吸干水分，肉眼观察结肠组织并评分。取病变严重处约1 cm于10%甲醛溶液中固定，行HE染色，显微镜下观察结肠形态学变化并根据Sykes标准评分［5］。组织病理学评分为肠上皮形态与炎症浸润积分之和。见表1。2）ELISA法检测各组大鼠血清里的TNF-α、IL-10含量。按照试剂盒说明书操作。

表1 结肠组织肉眼大体观及镜下病理学评分依据

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。正态分布时，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 各组大鼠按上诉药物治疗后：空白组大鼠精神可，活动自如，毛发光泽，大便颗粒状，无腹泻和便血；模型组大鼠精神萎靡，活动明显减少，毛发无光泽，大便腹泻或稀软，部分可见肉眼血便；治疗各组可见不同程度的缓解。

2.2 大鼠结肠肉眼观察结果 见图1。空白组大鼠结肠细长，肠腔光滑，黏膜皱襞完整清晰。乙酸造模后，病变结肠黏膜出现充血水肿，伴有糜烂及溃疡。治疗各组的大鼠结肠溃疡面减小，充血减轻，以中、低剂量青柏溃结汤组最好，柳氮磺吡啶组次之，高剂量青柏溃结汤组及康复新组较差。

2.3 大鼠结肠损伤大体评分 见表2。

图1 各组大鼠治疗后结肠黏膜肉眼观察结果

表2 各组大鼠治疗后结肠组织大体评分比较（n）

2.4 各组结肠组织病理观察结果 空白组大鼠具有结构完整的结肠黏膜，腺体整齐排列，无明显炎性细胞浸润；模型组大鼠的结肠黏膜结构被严重破坏，局部黏膜坏死、脱落，部分病变可达肌层，腺体排列紊乱或缺如，部分区域的细胞水肿、充血，可见形成的溃疡，细胞间质有大量浸润的炎性细胞；高剂量青柏溃结汤组、康复新液组未见明显愈合迹象，其余各治疗组有明显愈合迹象，中、低剂量青柏溃结汤组愈合最好，上皮和增生最多，炎性细胞浸润最少，柳氮磺吡啶组次之，见图2，组织学评分见表3。

图2 各组大鼠治疗后结肠病理学结果（HE染色，20倍）

2.5 各组血清TNF-α、IL-10含量比较 见表4。

3 讨 论

用乙酸法复制结肠炎模型是常用的UC模型之一，其机制可能与乙酸的化学刺激造成的结肠上皮细胞凋亡、黏膜屏障结构被破坏有关［6］，增加肠黏膜通透性，诱导炎性细胞的浸润、炎症介质的表达（TNF-α、IL）等［7］，此方法简便易行、稳定性好、可靠率高、周期偏短、成本较低，适用于开发新药和评估疗效［8］。

表3 各组大鼠治疗后组织学评分比较（分，±s）

表3 各组大鼠治疗后组织学评分比较（分，±s）

组别 n 组织学评分空白组 11 -模型组 9 6.60±0.89高剂量青柏溃结汤组 9 5.33±0.77中剂量青柏溃结汤组 9 4.42±1.24*低剂量青柏溃结汤组 9 4.27±1.50*柳氮磺吡啶组 9 5.02±1.18康复新液组 9 6.33±1.37

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-10含量比较（pg/mL，±s）

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-10含量比较（pg/mL，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与柳氮磺吡啶组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与康复新液组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 n空白组 11模型组 9高剂量青柏溃结汤组 9中剂量青柏溃结汤组 9低剂量青柏溃结汤组 9柳氮磺吡啶组 9康复新液组 9 TNF-α IL-10 46.35±12.25 80.94±7.93 108.72±23.84△37.52±4.95△△101.42±24.49 41.94±3.94△△67.38±18.84**##69.20±8.40**△△##66.49±18.76**△##66.04±4.73**△△##85.47±18.77*56.96±8.06**##102.95±21.85 42.00±5.99△△

目前人们越来越重视UC的发病机制，特别是细胞因子发病机制［9］。促炎性和抑炎性细胞因子两者失衡引起的异常被视作UC的重要发病机制［10］。TNF-α是公认的重要的促炎性细胞因子之一，由活化的T淋巴细胞和单核巨噬细胞分泌［11］，其引起肠道黏膜损伤的机制可能包括生成氧自由基和白三烯、促进释放血小板活化因子、诱导合成一氧化氮［12］，从而导致细胞损伤，用抗TNF单克隆抗体-英夫利昔单抗治疗的重症UC患者病情有所缓解也进一步说明了肿瘤坏死因子参与UC的病变过程［8］。IL-10又叫细胞因子合成抑制因子，目前大多认为IL-10是一种负向调节细胞因子，其对免疫炎症发展过程的多个环节皆有阻断作用，免疫抑制活性具有广泛性，可抑制多种促炎细胞因子的产生，周毅等［13］研究结果发现UC大鼠血清1L-10含量降低。

青柏溃结汤是我科的院内方，引用此方治疗UC患者已有10余年，从开始运用此方到现在，约有500个UC患者接受青柏溃结汤治疗，取得了不错的临床疗效。UC在中医学属于“久痢”范畴，病位在大肠，基本病机为湿热蕴肠、气滞络瘀。活动期多见腹痛、腹泻（大便为黏液脓血样）、里急后重等症，湿热蕴肠，气血不调为其主要表现［14］。自拟青柏溃结汤（原名溃结Ⅰ号方）灌肠治疗，组方中的大青叶和板蓝根清热、解毒、凉血，清除疫毒之邪；黄柏和苦参清热、燥湿，清除内蕴脏腑湿热。配炒薏苡仁利水、渗湿、清热、排脓，清肠道腐败脓血，佐乌贼骨制酸止痛、收敛止血。使用青柏溃结汤灌肠可清热化湿、调和气血［15］。

本研究发现，模型组大鼠的结肠黏膜结构被严重破坏，局部黏膜坏死、脱落，部分病变可达肌层，腺体排列紊乱或缺如，部分区域的细胞水肿、充血，可见形成的溃疡，细胞间质有大量浸润的炎性细胞；高剂量青柏溃结汤组、康复新液组未见明显愈合迹象，其余各治疗组有明显愈合迹象，中、低剂量青柏溃结汤组愈合最好，上皮和增生最多，炎性细胞浸润最少，柳氮磺吡啶组次之，说明青柏溃结汤具有明确缓解UC的功效，且治疗效果优于西药对照组柳氮磺吡啶及中药对照组康复新液。同时，本研究发现，模型组的TNF-α高于治疗组，IL-10则低于治疗组。综上所述，青柏溃结汤可能是通过降低细胞因子TNF-α，升高IL-10来抑制UC的炎症反应，关于青柏溃结汤治疗UC具体的作用机制有待进一步深究。

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Study on Effects of Qingbai Kuijie Decoction on Ulcerative Colitis Rats

ZHANG Lin，WU Jieqiong，ZHANG Wei，et al.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shanxi，Xianyang 712000，China.

Objective：To observe the effect of Qingbai Kuijie Decoction on the healing of colonic mucosa and serum cytokines in rats with ulcerative colitis induced by acetic acid.Methods：77 male SD rats were randomly divided into the control group，the model group，high dose group of Qingbai Kuijie Decoction，middle dose group of Qingbai Kuijie Decoction，low dose group of Qingbai Kuijie Decoction，sulfasalazine group and Kangfuxin Decoction group，11 cases in each.Except the control group，the remaining groups were modeled with acetic acid.Three days after modelling，the rats were given enema for 7 days.Then the colon tissues of each group were observed and scored.Serum levels of TNF-α and IL-10 were detected by ELISA.Results：Compared with the model group，the serum levels of TNF-α decreased and the content of IL-10 increased in the other groups.Conclusion：Qingbai Kuijie Decoction can significantly alleviate the damage degree of colon tissue in rats with ulcerative colitis，which may be related to the down-regulation of TNF-α and up-regulation of IL-10.

Qingbai Kuijie Decoction；Ulcerative colitis；IL-10；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1352-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.011

2017-05-26）

陕西中医药大学第二附属医院院内培育课题（2016QN02）；陕西省中医药管理局第五批省级中医药重点学科-中医脾胃病学（陕中医药发［2013］43号）

△通信作者（电子邮箱：2962128717@qq.com）