动物水平的绿原酸通过Notch1信号通路调控非小细胞肺癌凋亡及机制研究

李维 刘旭 张国倩 张琳琳

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,无论其发病率还是死亡率均居恶性肿瘤之首,已经成为严重危害人类生命健康的常见疾病.非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的一种,其患者数量为肺癌患者总数的80%以上[1].目前NSCLC的治疗措施主要有手术、放疗、化疗及生物治疗等,早期手术可以治愈NSCLC,但大部分NSCLC患者确诊时已属晚期,目前尚无治愈的根本疗法.研究[2]表明,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及Notch信号通路,对肿瘤的形成和发展具有重要作用.Notch信号通路高度保守,由Notch受体、Notch配体、CSL DNA结合蛋白(CBF-1, suppressor of hairless, Lag)、其他的效应物和Notch的调节分子等组成.当相邻细胞的Notch受体、配体相互接触时,γ-分泌酶催化裂解形成Notch胞内段,之后Notch胞内段进入细胞核内结合并激活转录因子RBP-Jk,调控转录因子超级组成员Hes和Hey分子的转录,从而调节细胞的分化、发育、增殖、凋亡等过程.Notch通路还与其他信号通路存在交叉调控,从而扩大其生物调节作用[3].目前已有不少研究Notch通路与肺癌的关系[4,5],可是尚未形成一个明确的结论,而Notch通路生物学作用下的具体的机制更是十分缺乏,仍然有待进一步研究.

近几年来,中药活性成分的抑癌作用得到了广泛关注,在诱导细胞凋亡方面的作用具有重要意义.绿原酸(chlorogenic acid, CGA)由奎尼酸(quinic acid, QA)与反式肉桂酸(trans cinnamic acidst-CA)缩合而成的酯类化合物家族,是多种中草药中的一种活性成分,具有抗炎作用、抗病毒作用、降血脂和血糖作用、抗氧化作用、增强机体免疫力等诸多生物学活性.已有研究[6]证明,绿原酸具有抑制肺癌细胞增值和转移,诱导肺癌细胞凋亡的作用.本研究建立了NSCLC细胞裸鼠模型,通过检测Notch信号通路及相互作用信号通路的关键蛋白的表达,进一步阐明绿原酸通过Notch1信号通路调控NSCLC凋亡的作用机制.

1 材料和方法

1.1 药品和试剂 绿原酸(250 mg, >98%)购自Sigma-Aldrich公司(溶解于1640培养基,0.22 μm滤膜过滤),胎牛血清购自上海沪峰化工有限公司,RPMI-1640培养液购自上海博麦德生物技术有限公司,胰蛋白酶购自GIBCO公司,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所,TRizol购自北京百奥森泰生物科技有限公司,总蛋白提取试剂盒购自Sigma-Aldrich公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海美吉生物医药科技有限公司,反转录试剂盒、SYBR Green Mix、DNA Marker购自北京全式金生物科技有限公司,PTEN抗体(兔抗)、p-PTEN抗体(p-Ser370,兔抗)、p-Akt(p-Ser473,兔抗)抗体购自Santa Cruz公司,Notch1抗体(兔抗)、GAPDH抗体(兔抗)、HRP-二抗(羊抗兔)等相关抗体购自Exapha Biologicals公司,其他试剂购自北京鼎国昌盛生物试剂公司.引物由上海英骏生物技术公司合成.

1.2 主要设备 多功能酶标仪(Wallac公司);TS-100倒置相差显微镜购自日本 Nikon公司;Real-time PCR仪购自BIO-RAD公司,二氧化碳培养箱(RCO3000TVBA)购自美国 REVCO公司.

1.3 实验动物 实验用裸鼠BALB/c-nu由北京华阜康生物科技有限公司提供许可证号:[SCXK(京)2014-0004],均为4周龄的健康SPF级雄性小鼠,体重为(18.77±1.02)g,裸鼠在无特定病原体条件下的层流架内饲养,无菌操作下定期更换笼具、垫料、饮用水和标准饲料.

1.4 细胞培养 NSCLC细胞株A549购自中国医学科学院中国协和医科大学细胞库,细胞培养液为含10%胎牛血清RPMI-1640,其中含终浓度为100 μg/mL青霉素和链霉素,2 mmol/L的L-谷氨酰胺;将细胞置于37oC、5% CO2孵箱中培养;2 d传代一次,取对数生长期细胞用于实验.

1.5 MTT法检测细胞增殖抑制率 将对数生长期A549细胞接种于96孔板中,每孔接种1X105个细胞;培养24 h之后,在培养基加入梯度浓度的绿原酸(终浓度为:0、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL),每个浓度设6个平行孔,绿原酸终浓度为0 μg/mL的为对照组;分别在药物处理A549细胞24 h、48 h、72 h后,每孔加入20 μL的5 mg/mL的MTT试剂,置于细胞培养箱中孵育4 h后吸出,加入150 μL的DMSO试剂,充分震荡后,用多功能酶标仪在490 nm波长下测定吸光度.计算细胞增殖抑制率.抑制率(%)=(1-药物处理组OD值/对照组OD值)X100%.

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡检测和细胞周期分析 将对数生长期A549细胞接种于6孔板,调节细胞密度,2 mL/孔,每孔细胞数目大约为4X105个.24 h后加入系列浓度梯度的绿原酸培养基,使绿原酸的终浓度为:0、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL;常规培养72 h后收集细胞,用195 μL的Bind Buffier重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC混匀,室温避光孵育10 min.离心去上清后,用190 μL的Bind Buffier重悬细胞,再加入10 μL碘化丙啶(100 mg/L),并与避光放置,随即进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并用软件进行数据分析.另一组细胞采用梯度绿原酸处理细胞72 h后收集细胞,PBS清洗后用预冷的95%乙醇处理,离心去上清后,碘化丙啶(100 mg/L)(含RNase 1 g/L)0.5 mL,室温避光孵育30 min,随即进行流式细胞仪进行细胞周期分析.

1.7 建立裸鼠成瘤模型 大量培养A549肺癌细胞,将生长状态良好的细胞消化后计数,将2X106的肿瘤细胞种植于裸鼠皮下,共接种30只裸鼠,饲养观察裸鼠成瘤情况.在接种2周-3周后,肿瘤大小约1 cm3时,选择肿瘤大小接近的20只小鼠,根据随机分层法分组,分为2组.实验组每天在肿瘤区域注射绿原酸溶液(100 μg/mL);对照组每天注射相同体积的生理盐水;每次注射体积为100 μL.连续观察并测量肿瘤的生长情况:每周测肿瘤长径(L),短径(W).肿瘤大小按公式V=1/2LW2计算.

给药4周后处死裸鼠取瘤称重,检查肝脏肺部肿瘤的转移情况.每个肿瘤取两部分,一部分用于提取瘤组织蛋白,另一部分提取组织RNA.

1.8 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测mRNA相对含量 取100 mg左右肿瘤组织,加入1 mL TRIzol,用研钵研磨至无明显肉眼可见固体.按照说明书操作步骤,提取RNA.然后按照反转录试剂盒步骤,将提取的RNA进行反转录,得到的cDNA用SYBR Green染料结合法,进行Real-time PCR.目的基因的相对表达量经过内参标化后分析(表1).

1.9 免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达 取少量肿瘤组织,按照总蛋白提取试剂盒步骤,提取组织总蛋白,用BCA法进行蛋白浓度测定(具体步骤见商品说明书).将蛋白液与蛋白上样缓冲液混合后,100oC变性10 min,然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.电泳后,取下凝胶,标记方向后进行转膜,封闭,孵育一抗(兔源Notch1、p-PTEN、PTEN、p-Akt抗体按照1:800浓度稀释比稀释,GAPDH抗体按照1:2,000浓度比稀释),孵育二抗(羊抗兔二抗按照1:5,000浓度稀释比稀释),最后经过充分洗膜后,进行曝光,分析结果.

1.10 统计学分析 采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析,数据均以均数±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用Student's t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 绿原酸对NSCLC A549细胞增殖的影响 绿原酸处理A549细胞48 h后,对照组细胞生长状态较好;而给药组细胞随着绿原酸剂量的升高,细胞脱落悬浮,破碎增多,部分细胞呈凋亡状态.

在绿原酸处理A549细胞24 h、48 h、72 h后,分别采用MTT法检测细胞增殖的影响.结果显示,与对照组比较,绿原酸对A549细胞的抑制率明显升高(P<0.05),并且呈现剂量依赖趋势.在100 μg/mL绿原酸作用在72 h时,抑制率达最高(61.63%)(表2).

2.2 绿原酸对NSCLC A549细胞凋亡和细胞周期的影响 流式细胞仪检测绿原酸作用于A549细胞72 h后,随着绿原酸浓度增加,G2期/M期细胞百分比逐渐增加,且均高于对照组,差异显著(P<0.05或P<0.01);随着给药浓度增加,细胞的凋亡率逐渐增加,均高于对照组,差异显著(P<0.05或P<0.01)(图1,表3).

2.3 绿原酸对A549细胞裸鼠荷瘤模型肿瘤增殖的影响 通过A549细胞裸鼠荷瘤模型发现,绿原酸能够抑制裸鼠肿瘤的生长增殖,实验组裸鼠肿瘤大小明显小于对照组,具有统计学差异(P<0.05),见表4、图2、图3.将裸鼠处死后,发现试验组裸鼠无转移瘤出现,而在对照组肺中发现有6例微小转移瘤.实验组肿瘤重量为(0.48±0.12)g,对照组为(0.83±0.22)g,两组比较差异具有统计学意义(P<0.01).

2.4 绿原酸对Notch信号通路相关分子mRNA表达量的影响 实验组Notch1的配体Delta4、VEGF的mRNA相对表达量明显小于与对照组(P<0.05).实验组Notch1信号通路下游效应分子HES1、HEY1的mRNA相对表达量明显降低(P<0.05).见图4.

2.5 绿原酸对PTEN-PI3K/AKT通路相关因子蛋白表达的影响 检测Notch1及PTEN-PI3K/AKT通路相关因子的蛋白表达水平,结果显示,与对照组比较,试验组Notch1蛋白表达明显降低,且p-PTEN、PTEN蛋白表达量升高,总的PTEN蛋白表达量增多;试验组p-Akt的表达量减少.见图5.

表 1 相关基因PCR引物Tab 1 Related gene PCR primers

表 2 绿原酸对A549细胞增殖的抑制作用(Mean±SD)Tab 2 Inhibitory effect of chlorogenic acid on proliferation of A549 cells (Mean±SD)

表 3 绿原酸对A549细胞周期分布时相的影响(Mean±SD)Tab 3 Effect of chlorogenic acid on the cell cycle profile of A549 cells (Mean±SD)

表 4 不同时间点裸鼠肿瘤大小的比较(Mean±SD, cm3)Tab 4 Comparison of tumor size in nude mice at different time points (Mean±SD, cm3)

3 讨论

绿原酸类物质是植物体中重要的次生代谢产物,广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中,杜仲、金银花、咖啡等植物中绿原酸类物质含量较高.绿原酸类物质可通过调节细胞周期、诱导凋亡、抑制细胞生长等途径产生抗癌作用,对肺癌、乳腺癌、肝癌具有显著的抑制作用,被认为是癌症的有效化学防护剂[6-8].但绿原酸对肺癌的抑制作用机制的研究并不多见.

Notch信号通路与人类许多肿瘤都存在密切的关系.Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用,Notch蛋白经过三次剪切,由胞内段释放入胞质,激活HES、HEY、HERP等碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)转录抑制因子家族的靶基因,发挥生物学作用.Notch信号通路不仅在组织器官的正常发育中起作用,还与一些肿瘤的发生、发展密切相关[9-13].有研究表明Notch信号通路在肺癌的发生发展起着重要作用[14],但是具体的作用机制一直没有达成共识.本文通过研究Notch受体、配体以及相关因子在非小细胞肺癌细胞裸鼠荷瘤模型中的表达,探讨Notch1信号通路与肺癌发生发展的关系,阐明绿原酸抑制非小细胞肺癌细胞凋亡的原理,同时为以Notch1信号通路为靶点的治疗提供分子机制方面的理论支持.

本研究发现,在细胞及动物水平上,绿原酸能有效抑制非小细胞肺癌细胞的生长增殖,促进细胞的凋亡.同时本研究发现实验组肺癌组织的Notch1 mRNA的平均表达水平显著下降,同时下调下游的HES1和HEY1 mRNA的表达,提示绿原酸可以通过Notch1信号通路转录水平调控非小细胞肺癌凋亡的.有研究[15]发现,抑制VEGF表达可以达到抑制人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的血管生成的作用.VEGF可诱导Notch1配体Delta4表达增高,从而可启动Notch信号传导通路.研究发现Notch信号通路配体Delta4以及VEGF的表达水平,发现实验组减少Delta4以及VEGF的mRNA水平的表达.因此,推测绿原酸可能是通过减少VEGF的表达,下调Delta4水平,从而抑制Notch1信号通路的活化.

图 1 绿原酸对A549细胞凋亡率的影响.实验组与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01.Fig 1 Effect of chlorogenic acid on apoptosis rate of A549 cells. The experimental group compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.

图 2 绿原酸对肿瘤生长增殖的影响Fig 2 Effect of chlorogenic acid on tumor growth and proliferation

图 3 两组裸鼠肿瘤比较Fig 3 Comparison of nude mice tumers of two groups

图 4 Real-time PCR检测Delta4、VEGF、Notch1、HES1、HEY1的mRNA表达水平.实验组与对照组比较,**P<0.01,*P<0.05.Fig 4 mRNA expression of Delta4, VEGF, Notch1, HES1,HEY1 detected by Real-time PCR. The experimental group compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01.

图 5 Western blot检测Notch1、PTEN、p-PTEN、p-Akt蛋白表达水平Fig 5 Expression of Notch1, PTEN, p-PTEN, p-Akt protein detected by Western blot

Notch信号通路不仅能够直接调控大量的基因表达,而且还可以与其他信号通路(包括TGF-β、NF-κB、Hif-1α等)相互作用而扩大其调控范围[16-18].近年来,Notch通路与PI3K-AKT等通路之间的互相作用受到广泛的关注抑癌基因PTEN在PI3K-AKT信号通路中发挥着至关重要的作用,PTEN的失活会导致PI3K-AKT通路活化,PTEN能够使磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP3)脱磷酸,使PIP3磷酸化呈低水平,抑制AKT的活化,从而下调PI3K/AKT通路相关因子表达.在PI3K-AKT通路中,PTEN有时候以磷酸化形式(p-PTEN)出现,继而启动下游级联反应,导致一系列生物学行为的发生.AKT磷酸化激活下游信号因子活化.本研究检测Notch1信号通路与PTEN-PI3K/AKT通路的相互作用是否存在交叉调控,结果发现,试验组的 p-PTEN、PTEN蛋白表达量都出现了一定程度的升高,总的PTEN蛋白表达量增多;与对照组比较,试验组p-Akt的表达量减少.提示Notch1通路可能通过对抑癌基因PTEN的调控来影响肺癌细胞的生物学功能,通过PTEN与PI3K/AKT通路存在交叉调控作用.

Notch信号通路非常复杂,且调控机制目前仍未清楚阐明.Notch信号通路在肿瘤的发生发展中非常重要,但是目前该通路的研究以及Notch信号通路与其他信号通路的交叉调控方面的研究相对较少,希望能后续进一步详细阐明Notch信号通路的生物学作用机制,填补这一块研究的空白,为肺癌的靶向治疗提供更有力的理论基础.