慢性乙型肝炎和肝硬化患者血浆m iR-181a水平变化*

邓 鑫，吴 剑

·短篇论著·

慢性乙型肝炎和肝硬化患者血浆m iR-181a水平变化*

邓 鑫，吴 剑

目的 探讨慢性HBV感染者血浆微小RNA(miRNA)-181a的变化。方法 采用实时荧光定量PCR法检测20例乙型肝炎病毒携带者（ASC）、20例慢性乙型肝炎（CHB）患者、20乙型肝炎肝硬化（LC）患者和20例健康人血浆miR-181a水平，常规检测血清HBV DNA。结果 NC 组、ASC组和 LC组血浆 miR-181a水平分别为（1.01±0.03）、（0.97±0.02）、（0.91±0.02），而CHB组患者为（0.74±0.03），显著低于前三组（P＜0.001）；ASC 组和 LC 组血清 HBV DNA（3.86±2.89）lg copies/m l和（2.47±3.26）lg copies/ml，而CHB组患者为（8.96±1.63）lg copies/m l（P＜0.001）；CHB患者血浆miR-181a水平与HBV DNA水平呈负相关（r=0.76，P＜0.001）,ASC组和LC组血浆miR-181a水平与HBV DNA水平无显著相关性。结论 CHB患者血浆miR-181a水平降低，其意义还需要进一步探讨。

慢性乙型肝炎；血浆miR-181a；HBV DNA

Chronic hepatitis B；Plasma miR-181a；HBV DNA

microRNA（miRNA）是一类非编码单链小RNA 分子，广泛存在于动物、植物和病毒中，广泛参与诸如细胞生长、分化、凋亡、肿瘤发生以及病毒感染发病机制等多种生命过程的调节[1-5]。随着miRNA和生物信息学领域研究的不断推进，寻找疾病相关的特异性miRNA已经成为研究的热点[6]。本研究通过对乙型肝炎病毒携带者（hepatitis B virus carriers，ASC）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者外周血 miR-181a水平检测，旨在为CHB患者提供潜在的基因诊断标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2016年1月～2016年8月西南医科大学附属第一医院门诊或住院的ASC 20例，男12例，女8例，平均年龄（35.5±12.1）岁；CHB 患者20例，男 11例，女 9例，平均年龄（38.6±10.7）岁；LC患者20例，男13例，女7例，平均年龄（52.3±14.6）岁。诊断依据2010年中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合制定的慢性乙型肝炎防治指南。排除标准：（1）近6个月内应用过α干扰素、皮质激素等药物治疗的患者；（2）合并其他肝炎病毒感染者；（3）合并肝脏肿瘤者。另选在我校附属第一医院行健康体检者20例作为NC组，男13例，女7例，平均年龄（34.3±12.8）岁。本研究所有入组者均遵循自愿参加原则，签署知情同意书，并经过西南医科大学医学伦理委员会批准。

1.2 血浆miR-181a定量检测 抽取外周血1 m l，EDTA抗凝，经两次离心（2000 g，5 min；15000 g，10 min，均在 4℃进行，Eppendorf公司），以彻底去除细胞及细胞碎片。使用Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）提取血浆RNA，将获得的RNA保存于-80℃冰箱（Thermo fisher公司）。凝胶电泳（Bio-Rad公司）检测RNA完整性，经NanoDrop分光光度计测定RNA浓度和纯度。按逆转录试剂盒（Takara公司）说明书步骤合成cDNA，在冰上预冷的RNase free EP管中加入RNA 模板 6 μl，2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μl，0.1%BSA 2 μl，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μl，总体积20μl，37℃孵育60 min，行PolyA加尾和反转录反应，随后向上述RT反应液中添加RNAase Free H2O至100μl，取2μl进行定量检测。采用SYBR Green和Stepone Plus实时定量PCR 仪（ABI公司）检测miR-181a水平，以U6作为内参进行相对定量分析，miRNA定量反应体系按照12.5μl SYBR Premix Ex Taq，1 μl PCR Primer（miR-181a，Forward primer:5’-AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3’，reverseprim er： 使 用 试 剂 盒 自 带 特 定 引 物 ；U6，Forward primer:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，reverse primer：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’），2 μl 模 板 ，ddH2O 8.5μl配置，总体积25μl，每个样品设置3个平行孔。扩增程序为：预变性 95℃ 30 s；40个循环：95℃ 5 s，60℃ 20 s；采用2-ΔΔCt法计算miR-181a相对水平。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 血清HBV DNA检测 采用PCR法（广东达安基因公司）。

2 结果

2.1 各组人群血浆miR-181a水平比较 与NC组比，CHB患者血浆miR-181a水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），而ASC和LC组与NC组比无显著性差异（图1）。

图1 各组血浆MiR-181a水平比较

2.2 不同类型肝病患者血清HBV DNA水平比较 CHB患者血清 HBV DNA 水平为（8.96±1.63）lg copies/m l，显著高于 ASC组的（3.86±2.89）lg copies/m l或 LC组的（2.47±3.26）lg copies/ml，差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.3 各组患者血浆miR-181a与HBV DNA载量的相关性CHB组血浆miR-181a水平与血浆HBV DNA呈负相关（r=-0.7629，P＜0.001,图 2A），而在 ASC 组（r=-0.3248，P＞0.05,图 2B）和 LC 组（r=-0.2677，P＞0.05，图 2C））血浆 miR-181a水平与血浆HBV DNA无明显相关性。

图2 三组患者血浆miR-181a与HBV DNA水平相关性

3 讨论

miRNA是大小约18～25个碱基的非编码单链小分子RNA，能通过与靶基因3’端非翻译区（3'-UTR）的碱基不完全配对，调控基因的表达，抑制mRNA翻译[2]。已有研究发现miRNAs水平异常与HBV感染有关[9]。在HepG2 2.2.15细胞过表达miR-199a-3p和 miR-210可以抑制HBV复制[10]。有人发现肝癌患者血浆 miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和 miR-801 均有明显的变化[9]。

miR-181a是miR-181家族重要一员，在肝脏生理和病理过程中具有重要作用。Brockhausen et al发现miR-181a介导的TGF-β表达上调参与了肝硬化或肝癌的发生[10]。HepG2.2.15细胞miR-181a、miR-181b、miR-200b和miR-146a水平升高[11]，提示miR-181a可能与乙型肝炎病毒感染有密切的联系。本研究采用定量PCR检测技术分析比较了ASC、CHB、LC和NC血浆miR-181a水平，结果显示 CHB组miR-181水平降低，其意义还需要研究。

宿主miRNA可以抑制病毒复制，同时还可以直接调节病毒抗原表达而抑制病毒复制[12]。近年来，miR-181a作为肿瘤诊断标志物在子宫内膜癌[13]、鳞状上皮细胞癌[14]和乳腺癌[15]中得到了广泛深入的研究。CHB患者血浆 miR-181a水平与病情、抗病毒疗效或与肝细胞癌发生的关系等，均需要深入研究。

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（收稿：2016-11-28）

（本文编辑：陈宗炳）

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.031

四川省教育厅科研项目(编号：16ZB0208);四川省卫生和计划生育委员会科研项目（编号：16ZD033）；西南医科大学科研基金资助项目（编号：2014QN-042）

646000四川省泸州市 西南医科大学药物研究中心（邓鑫）；附属第一医院医学实验中心（吴剑）

邓鑫，男，28 岁，硕士研究生。E-mail：780244355@qq.com

吴剑.，E-mail:hankbergcn@163.com

Plasm a m iR-181a levels in patients w ith chronic hepatitis B Deng Xin,Wu Jian.Drug and Functional Food Research Center,Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan Province