补肾调经方药对排卵障碍不孕患者子宫内膜的影响

张金婷 王淑民 白兢毳 杜淑英 李巧凤 朱晓红 张 斌 王 宁＊张树成

1.河北省承德县妇幼保健和计划生育技术服务中心（067400）；2.北京市朝阳区太阳宫社区卫生服务中心；3.河南省新密市妇幼保健和计划生育技术服务中心；4.国家卫生计生委科学技术研究所

补肾调经方药对排卵障碍不孕患者子宫内膜的影响

张金婷1王淑民1白兢毳2杜淑英3李巧凤3朱晓红4张 斌4王 宁4＊张树成4

1.河北省承德县妇幼保健和计划生育技术服务中心（067400）；2.北京市朝阳区太阳宫社区卫生服务中心；3.河南省新密市妇幼保健和计划生育技术服务中心；4.国家卫生计生委科学技术研究所

目的：观察补肾调经方药对子宫内膜的影响。方法：对排卵障碍不孕妇女45例，采用服药前后自身对照方法，通过中药方药治疗和随访各3个周期，进行临床观察和B超检测；服药前后分别于增殖晚期、分泌中期和分泌晚期刮取子宫内膜进行形态学、免疫组织化学检测。结果：服药后月经、排卵、子宫内膜等均有改善，总妊娠率为35.6%；子宫内膜的腺体细胞和间质细胞的功能状态与月经周期发育各个时同步化能力和8种细胞因子的表达均较服药前明显增强。结论：补肾调经方药可以促进子宫内膜发育，改善子宫内膜的接受性，提高内膜细胞活性，从而提高妊娠率。关键词 补肾调经，子宫内膜，卵泡发育，妊娠率，形态学

子宫内膜对孕卵的接受性（子宫内膜感受态）对妊娠的建立十分重要。在多数妊娠失败病例中除了胚胎因素外，子宫内膜发育不佳、不能达到接受状态成为影响辅助生殖成功的主要因素之一。使用激素类进行促（超）排卵药物，可以在受体水平上阻断雌激素作用，导致子宫内膜DNA合成受阻，造成患者子宫内膜发育迟缓，内膜与卵泡发育不同步。祖国传统医学注重整体调理，采用中西医结合治疗方法被更多尝试在超排卵、辅助生殖医学领域。中药复方具有改善排卵能力，促进卵泡发育，同时可以同步调节子宫内膜容受性和输卵管功能，促进受孕成功多环节的内环境。meta分析和系统评价基于目前的证据可以说明复方中药干预辅助生殖技术具有良好的效果和安全性，可提高临床妊娠率、受精率、种植率和优秀胚胎率，降低流产率［1］。通过前期临床观察，补肾调经方药具有明确的调经、促排卵、健内膜作用［2］。为进一步认识补肾调经方的作用，本文对子宫内膜的病理学变化和相关因子的免疫组化进行研究。

1 材料和方法

1.1 观察对象

根据诊断标准［34］选择因排卵障碍不孕妇女45例为观察对象。受试者平均年龄28.3（22～36）岁，平均不孕年限3.3（2～11.5）年；原发、继发性不孕分别为22、23例，月经周期39～60d；主要表现为卵泡发育生长缓慢、停育、变性、无优势卵泡和子宫内膜薄、分泌期子宫内膜反应比正常月经周期相差两天以上等。受试者半年内无甾体激素药物或其它影响生殖的中西药物使用，有至少3个月经周期明确记录，常规妇科检查正常，排除器质性病变；有完整的内分泌性激素测定结果；有至少一个周期的连续B超监测结果。男方发育正常，精液检查正常；双方免疫性不育因素均经过检查和治疗显示正常。

1.2 药方

补肾调经方药为协定处方，功能为补肾填精、养血活血、调经助孕，由当归、菟丝子、枸杞子、女贞子、覆盆子、山萸肉、何首乌、巴戟天、熟地、山药、甘草等组成［2］，水煎服，每日1剂，分2次服用。

1.3 治疗和观察方法

采用自身对照方法观察。治疗前，观察对象连续记录3个月经周期，并行≥2个周期的B超监测，选择3个观察周期中最接近正常的临床指标作为对照数据。于月经第5d开始服用补肾调经方药，根据连续B超监测确定排卵日，记录卵泡大小和子宫内膜厚度。当有排卵发生即停止服用中药，若连续服用18d仍未排卵发生时服用至月经周期第23d停止服药；若妊娠不再服用中药行妊娠期观察。若未妊娠次月第5天继续服用中药。连续服用中药3个周期，作为治疗后数据分析并继续随访观察3个周期。1.4子宫内膜样本采集和处理

以B超监测确定的排卵日为LH 0，排卵前2d为LH－2（增殖晚期），排卵后7天和10天分别为LH＋7（分泌中期）和LH＋10（分泌晚期）。在治疗前和治疗后第2个周期分别于增殖晚期、分泌中期、分泌晚期子宫内膜取材，每名观察对象仅选取1个时相在治疗前和治疗后相同时相取材。将观察对象随机分为增殖晚期、分泌中期、分泌晚期共3个内膜取材时相，服药前分别为18、16、11例，共45例；服药后分别为各12、10、10例，共32例（其他13例失访或未能获得取材组织）。子宫内膜组织经Bouin固定，经常规水洗、脱水、浸蜡、包埋、5μm石蜡切片，行常规苏木精－伊红（HE）染色，脱水，透明，封片，镜检。根据文献［5］标准确定子宫内膜组织学分期。

1.5 免疫组化染色和分析

免疫组化染色方法采用SP法，封闭血清为正常山羊血清，一抗购自R＆D或abcam公司。抗体滴度1200～1800，3%的过氧化氢封闭。加一抗于4℃孵育过夜，使用通用型生物素标记的二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素S－A／HRP工作液，DAB显色，阴性对照一抗为正常羊血清。进行13种因子的免疫组化，分别为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、雌激素调节蛋白（PS2）、增殖细胞核抗原（PCNA）、血管内皮生长因子（VEGF）及受体（VEGFR）、转化生长因子（TGF）及受体（TGFR）、表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子（FGF）、纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）及受体（LNR）。免疫组织化学染色采用双盲法根据阳性反应颗粒强度和分布程度进行定性分析，特异性着染强度以阴性（－）、弱阳性（±）、阳性（＋）、强阳性（2＋）、极强阳性（3＋、4＋）表示。

1.6 资料整理和统计分析

卵泡测定以（长径×短径）12换算为卵泡标准大小。采用SPSS11.5软件包处理数据和统计学分析，单因素方差分析、配对资料t检验、χ2检验，以均值±标准差表示。

2 结果

2.1 妊娠和流产情况

45例观察对象，服药后1、2、3个周期和随访观察1、2、3个周期分别妊娠2、6、4例和2、1、1例，累计妊娠率分别为4.4%（2／45）、17.8%（8／45）、26.7%（12／45）和31.1%（14／45）、33.3%（15／45）、35.6%（16／45）；服药3个周期内妊娠率为26.7%（12／45），随访观察3个周期内妊娠率为12.1%（4／33），总妊娠率为35.6%（16／45）。共有2例（2／16）发生流产。

2.2 月经变化

所有观察对象服药前均月经不调。服药后各观察时期月经不调和月经性状明显改善（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

2.3 排卵情况

不同服药时期卵泡发育情况比较，均显示服药后卵泡发育明显改善（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

表1 观察对象服药前后月经情况变化比较［例（%）］

表2 观察对象服药前后卵泡发育和排卵变化比较

2.4 子宫内膜发育情况

服药前和服药后1、2、3个周期子宫内膜厚度在LH－2时分别为6.7±2.1、8.2±1.8、9.1±1.9、9.5± 2.3mm，在LH0时分别为7.1±1.9、8.8±1.6、9.6± 1.9、10.6±2.2mm，服药后子宫内膜发育好于服药前（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 子宫内膜组织形态学变化

2.5.1 LH－2 此期共12例。在服药前，内膜增殖表现不良11例（增中期2例、后期2例、末期4例、晚增前期3例），腺体数目少、分布疏松不均匀；腺腔分化程度低，腺腔小而圆，腺体功能差；显示形态学滞后、正常发育状态不同步11例；处于正常增殖子宫内膜仅1例。在服药后，内膜增殖表现不良3例（中增末期1例、晚增前期2例），正常晚增中期9例。子宫内膜发育不良者服药后比服药前减少了8例（8／12）（P＜0.01）。

2.5.2 LH＋7 此期共10例。在服药前，8例内膜发育不良，表现为仍停留在增殖期，腺上皮仍为假复层；腺体细胞小，数目少，弯曲扩大程度低；间质主要为细胞数目较少，梭形（小细胞）和星形（大细胞）细胞同时可见各占50%左右；小动脉和血管增生不明显；处于正常分泌表现者2例。在服药后，内膜发育不良1例；符合正常分泌特征表现者9例，内膜中腺体发育充分，出现核下空泡，顶浆分泌的细胞减少；间质细胞水肿明显。子宫内膜发育不良者服药后比服药前减少了7例（7／10）（P＜0.01）。

2.5.3 LH＋10 此期共10例。服药前，10例内膜均发育不良，处在中泌期（初期、中期），子宫内膜发育不同步，滞后于正常晚泌的状态，子宫内膜的腺体扩张弯曲程度低，顶浆分泌和核下空泡偶见；在间质细胞数目少，细胞分化延迟，小动脉和血管增生不明显。在服药后，正常发育内膜7例，内膜发育不良3例。子宫内膜发育不良者服药后比服药前减少了7例（7／10）（P＜0.01）。

2.6 子宫内膜活性因子的影响

进行了13种因子的免疫组化分析，主要分为3种类型：细胞生长因子及生长因子受体类（VEGF、VEGFR、TGF、TGFR、EGFR、FGF；细胞粘附分子类（FN、LN及LNR）和其他（ER、PR、PS2和PCNA）。见表3。①细胞生长因子及受体：EGFR、TGF在排卵前后表达强度逐渐增加（分泌晚期比分泌中期、增殖晚期强），TGFR排卵后表达强度逐渐降低（分泌晚期比分泌中期弱）。与服药前相比，服药后增殖晚期的EGFR表达明显增强；分泌中期、分泌晚期组EGFR略有增强，VEGF增强，FGF明显增强。服药前后TGF、TGFR、VEGFR均无变化。②细胞粘附因子：服药后与服药前比较，LN、LNR在各组均明显增强；FN在各组表达均阳性，FN在增殖晚期、分泌中期组明显增强。③其它相关因子：PR排卵前后（增殖晚期～分泌晚期）强度逐渐降低（增殖晚期比分泌中期表达高，分泌晚期不表达）。服药前后比较PCNA、PS2在各组均为服药后明显增强，ER在增殖晚期、分泌中期组服药后明显增强，PR在增殖晚期组服药后明显增强、在分泌中期组服药后略有增强。见表3。

表3 观察对象不同时期各细胞因子免疫组化表达定性分析

3 讨论

人子宫内膜因取材受限影响了在体观察以及中药治疗效果的全面评价，故以往的相关研究多集中在动物实验，而采用离体人子宫内膜进行研究是目前最理想的手段。中医药强调整体辨证施治，对不育症的治疗突出局部作用又兼顾整体效果，在临床上取得了较好的疗效［67］。本研究在中医“肾主生殖”“肾藏精”“精满则子宫易于摄精，血足则子宫易于容物”的理论指导下，通过调经孕育方药对排卵障碍性不孕患者子宫内膜组织形态进行观察，研究中药对“植入窗口期”子宫内膜感受态变化的影响，探讨中药对子宫内膜刺激作用的机制。

在正常妇女月经周期的整个增殖期内，上皮和间质细胞分裂增殖，内膜功能层生长增厚，功能活跃旺盛。旺盛的分泌反应，为精子的运行和获能提供了基本的适宜条件，是胚胎着床的基本保证。胚泡的正常植入需要子宫内膜处于感受状态，子宫内膜接受性的改善可能涉及改善子宫内膜蜕膜化反应、促进细胞因子和生长因子的分泌、增加子宫内膜和胚胎发育的协调性等方面［8］。

内膜中活性物质的协调和表达对着床的成立极为重要，这些活性物质主要为激素、激素受体、早孕相关因子和早孕相关因子受体。细胞因子可以介导甾体激素对子宫内膜的调节作用。当不孕妇女服用补肾调经方后，方药促进调节此期内膜活性物质的变化。在增殖晚期有10种增强，EGFR、LN、LNR、FN、PS2、ER、PR、PCNA等8种明显增强，这8种因子主要与促进细胞增殖分化、与激素和细胞粘附相关［911］。通过这些因子的作用，影响子宫内膜的生理状态和胚胎植入的局部微环境，改善子宫内膜的容受性，有利于对着床的过程进行精细的调控［12］。

本研究所观察的细胞因子（VEGF、TGF、FGF、VEGFR、TGFR、EGFR）同时也是促血管生成因子。在子宫内膜发育的不同时相均有表达，服用中药后增殖晚期、分泌中期、分泌晚期具有不同强度的增强，这些结果提示不孕妇女服用补肾调经方药后，促血管生成活性明显增强，符合正常生理状态下“血”、“脉”充沛盈盛表现。从微观角度看，服用中药后增殖期的内膜分化增殖能力明显改善，内膜明显增厚，增殖旺盛；分泌期子宫内膜发育同步，分泌晚期细胞分泌活动增强；相应时相标志性细胞因子表达增加，细胞活性增加。显示出补肾调经方整体调节作用的优势。补肾调经方调节子宫内膜容受性的精密机制以及提高妊娠率的协调机制还有待进一步深入研究。

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［责任编辑：董 琳］

Influence of Bushen Tiaojing Decoctin on endometrium of infertile women with ovulation failure

ZHANG Jinting1，WANG Shumin1，BAI Jingcui2，DU Shuying3，LI Qiaofeng3，ZHU Xiaohong4，ZHANG Bin4，WANG Ning4＊，ZHANG Shucheng4
1.Maternal＆child and Family Planning Service Center of Chengde County，Hebei，067400；2.Community Health Service Center of Chaoyang district，Beijing；3.Maternal＆child and Family Planning Service Center of Xinmi city，Henan；4.National Research Institute for Family Planning，Beijing
＊

wangn333＠126.com

Objective：To investigate the influence of Bushen Tiaojing Decoction on endometrium.Methods：Forty five infertile women with ovulation failure were included and observed by self－control method before and after taking Bushen Tiaojing Decoction.All women were followed up 3months after taking medicine，and the outcomes were obtained by observation of clinical symptoms and ultrasound.The endometria of included women were collected for morphological and immunohistochemical detection before and after medicine in late proliferation stage，mid secretory and late secretory stage.Results：Bushen Tiaojing Decoction regulated menstruation，promoted ovulation，and enhanced endometrial development.The total pregnancy rate was 35.6%in these women.The development of gland and the stromal cells synchronized with the menstrual cycle，and eight cytokines were highly expressed after treatment，so it indicated endometria activity and function increased.Conclusion：Bushen Tiaojing Decoction can promote endometrial development，improve endometrial receptivity，and improve pregnancy rate of infertile women.

Bushen Tiaojing；Endometrium；Pregnant rate；Morphology

10.3969／j.issn.1004－8189.2017.04.004

国家重点基础研究发展计划（973计划，2010CB530403）；国家自然科学基金（90409016）

2017－02－13

2017－02－23

＊通讯作者：wangn333＠126.com