小胶质细胞上非受体型酪氨酸激酶Src通过磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白调节神经炎症的机制

操胜男，余文雯，臧彩霞，鲍秀琦，孙 华，张 丹

中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050

小胶质细胞上非受体型酪氨酸激酶Src通过磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白调节神经炎症的机制

操胜男，余文雯，臧彩霞，鲍秀琦，孙 华，张 丹

中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050

目的 研究小胶质细胞上非受体型酪氨酸激酶Src通过第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)编码的PTEN蛋白调节细菌脂多糖(LPS)诱导神经炎症反应的分子机制。方法 采用LPS诱导小胶质细胞系BV2，Western blot法检测蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平评价PTEN活性，酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α含量评价神经炎症反应；加入PTEN抑制剂以及Src的小干扰RNA后，观察神经炎症反应的变化，研究Src调控神经炎症机制。结果 LPS诱导BV2细胞激活后，Akt磷酸化水平显著升高(P<0.001)，肿瘤坏死因子-α释放量显著增多(P<0.001)，即引起明显的神经炎症反应。而抑制PTEN蛋白活性后，LPS诱导的Akt磷酸化水平进一步升高(P<0.05)，炎症因子释放量进一步增多(P<0.001)；干扰Src基因后，Src蛋白表达量明显下降(P<0.001)，同时LPS诱导的炎症因子释放量与未干扰Src组相比明显减少，炎症反应减轻(P<0.001)；PTEN和Akt磷酸化水平也明显下降(P<0.001)。结论 在小胶质细胞上Src激酶可能通过调节PTEN蛋白活性调控神经炎症反应。

Src激酶；神经炎症；小胶质细胞；磷酸酶张力蛋白同源物基因

非受体型酪氨酸激酶Src激酶是非受体型酪氨酸激酶家族的成员之一，在哺乳动物的中枢神经系统内广泛表达，参与细胞的多种生理功能和信号转导，包括细胞稳态的维持、细胞形态调控及细胞迁移的调控等[1]。有报道Src参与小胶质细胞内多条信号通路，对小胶质细胞的吞噬、黏附、激活、炎症因子的产生等多个过程都有重要的作用，从而与神经炎症有密不可分的关系，然而其具体机制仍不清楚[2]。磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology protein，PTEN)是具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的双重特异性磷酸酶，能够使磷脂酰肌醇三磷酸脱磷酸化生成磷脂酰肌醇二磷酸，从而负性调控Akt信号通路介导的细胞生长增殖及炎症反应等过程[3]。PTEN的活性受到上游多种调控，如乙酰化、泛素化、磷酸化等，其中磷酸化对其活性有重要的调控作用，PTEN被磷酸化后活性降低[4]。Src激酶在PTEN磷酸化过程中发挥重要作用，可磷酸化PTEN使其活性降低[5]。本研究观察Src激酶与PTEN在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小胶质细胞炎症反应中的作用，探讨Src激酶调控神经炎症反应的可能机制，为神经退行性疾病机制研究提供实验依据。

材料和方法

材料和仪器 小鼠小胶质细胞BV2细胞株购自中国医学科学院国家实验细胞共享服务平台，DMEM高糖培养基购于北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司，LPS(型号：L4391)购于Sigma公司，bpv(HOpic)(型号：ALX- 270- 205-M005)购于Enzo公司，Src siRNA购于Introvigen公司，转染试剂 Lipofactamin RNAiMAX、OPti-MEM培养基均购于Life Technology公司，鼠抗Akt单克隆抗体(型号：2920)、兔抗磷酸化-Akt单克隆抗体(型号：4060)、兔抗PTEN多克隆抗体(型号：9552)、兔抗磷酸化-PTEN单克隆抗体(型号：9549)、兔抗Src单克隆抗体(型号：2109)、兔抗磷酸化-Src多克隆抗体(型号：2101)均购于Cell Signaling Technology公司；鼠抗GAPDH单克隆抗体(型号：TA- 08)、辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(ZB2305、ZB2301)均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α检测试剂盒购于北京欣博盛生物科技有限公司。倒置显微镜(日本Olympus公司，型号：TH4- 200)、酶标仪(美国Bio-Tek公司)、超灵敏化学发光成像仪(GE lmageQuant LAS 4000)、DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、CO2培养箱(美国NAPCO公司)。

细胞培养及分组 将BV2细胞置于含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml及链霉素100 U/ml的DMEM高糖培养基中，在37℃、5% CO2的培养箱内培养，2～3 d传代1次。抑制PTEN实验分为4组，分别是对照组、模型组(LPS组)、bpv(HOpic)抑制PTEN后LPS刺激组[bpv(HOpic)+LPS组]及bpv(HOpic)抑制PTEN组[bpv(HOpic)组]。Src 小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)干扰实验分为4组，分别是对照组、模型组(LPS组)、Src siRNA干扰后LPS刺激组(Src siRNA+LPS组)及Src siRNA干扰组(Src siRNA组)。

bpv(HOpic)对PTEN活性的影响 将细胞按106细胞/孔种于6孔板内培养24 h使细胞贴壁，细胞融合度为80%～90%。PTEN抑制剂bpv(HOpic)母液浓度为2 mmol/L，加入bpv(HOpic)终浓度为50 nmol/L孵育2 h后更换培养基，加入用完全培养基稀释的LPS，终浓度为1 μg/ml，刺激6 h后收集标本。

siRNA干扰技术对Src激酶表达的影响 将细胞按105细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，在培养箱中培养24 h后，细胞融合度为40%～50%。按照操作说明书进行转染，Src siRNA终浓度为50 nmol/L，转染4 h后更换培养基，继续放入培养箱中培养。Src siRNA的序列为：上游：GCGGCUGCAGAUUGUCAAUTT；下游：AUUGACAAUCUGCAGCCGCTT。阴性对照siRNA序列：上游：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；下游：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。继续培养48 h后更换培养基，加入用完全培养基稀释的LPS，终浓度为1 μg/ml，刺激6 h后收集标本。

ELISA法检测TNF-α水平 收集6孔板中细胞培养基，4℃ 2000 r/min离心(转子半径为10 mm)10 min，取上清液按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测各组TNF-α表达水平。显色后在酶标仪450 nm波长检测吸光度，建立标准曲线并计算TNF-α数值。

Western blot法检测Src蛋白表达水平及PTEN、Akt磷酸化水平 在LPS刺激作用后，常规提取各组蛋白并测定浓度。在12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行电泳，条件为70 V，30 min及90 V，60 min，蛋白上样量为40 μg；采用湿转法将蛋白转入聚偏二氟乙烯膜中，转膜条件为恒流，300 mA，90 min；5%奶粉封闭1 h；加入一抗(1∶1000)4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次10 min，加入相应二抗(1∶2000)孵育2 h后TBST洗涤3次；加入适量增强化学发光液在成像系统中显影，并采用软件Gel Pro进行图像分析。

统计学处理 应用SPSS 17.0进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，不同组间差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两比较采用LSD方法分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

PTEN在神经炎症中的作用 与对照组相比，LPS诱导BV2细胞中Akt磷酸化水平显著增加(P<0.001)，而抑制PTEN活性后，LPS诱导的Akt磷酸化水平进一步增加(P<0.05)(图1A)。炎症因子TNF-α释放量测定结果显示，与对照组相比，LPS诱导BV2细胞炎症因子含量显著增加(P<0.001)，而抑制PTEN活性后LPS诱导的炎症因子含量进一步增加(P<0.001)(图1B)。

Src激酶在神经炎症中的作用 与对照组相比，siRNA干扰后Src表达水平显著下降(P<0.001)(图2A)。炎症因子TNF-α释放量测定结果显示，与对照组相比，LPS诱导BV2细胞炎症因子释放量显著增加(P<0.001)，Src表达降低后LPS诱导的炎症因子释放量显著降低(P<0.001)(图 2B)。

Src激酶对PTEN活性的调控作用 Src激酶表达减少后，PTEN及Akt磷酸化水平均显著降低(P<0.001)(图3)。

PTEN：磷酸酶张力蛋白同源物基因；LPS：细菌脂多糖；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化蛋白激酶B；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；ELISA：酶联免疫吸附法；bpv(HOpic)+LPS：bpv(HOpic)抑制PTEN后LPS刺激组；bpv(HOpic)：bpv(HOpic)抑制PTEN组；Mr：相对分子质量；1：对照组；2：LPS模型组；3：bpv(HOpic)+LPS；4：bpv(HOpic)；同对照组比较，aP<0.001；同LPS模型组比较，bP<0.05，cP<0.001PTEN：phosphatase and tensin homology protein；LPS：lipopolysaccharide；Akt：protein kinase B；p-Akt：phospha-protein kinase B；TNF-α：tumor necrosis factor-α；ELISA：enzyme linked immunosorben assay；bpv(HOpic)+LPS：bpv(HOpic)inhibition of PTEN with LPS stimulation group；bpv(HOpic)：bpv(HOpic)inhibition of PTEN group；Mr：relative molecular mass；1：control group；2：LPS model group；3：bpv(HOpic)+LPS；4：bpv(HOpic)；aP<0.001 compared with control group；bP<0.05，cP<0.001 compared with LPS model group

A.PTEN抑制剂bpv(HOpic)处理BV2细胞后，采用蛋白自印迹Western blot法检测各组Akt磷酸化水平；B.采用ELISA法检测各组TNF-α释放量

A.with PTEN inhibitor bpv(HOpic)treatment in BV2 cells，the expression of Akt and p-Akt were analyzed by Western blot assay；B.the release of TNF-α was analyzed by ELISA assay

图 1 PTEN抑制剂bpv(HOpic)处理BV2细胞引起LPS诱导的神经炎症水平变化

Fig 1 PTEN inhibitor bpv(HOpic)treatment influences LPS-induced neuroinflammation level in BV2 cells

siRNA：小干扰RNA；Src siRNA+LPS：Src siRNA干扰后LPS刺激组；1：对照组；2：Src siRNA干扰组；3：阴性对照组；与对照组比较，aP<0.001；与LPS模型组比较，bP<0.001

siRNA：small interfening RNA；Src siRNA+LPS：Src siRNA interference with LPS stimulation group；1：control group；2：Src siRNA interference group；3：negative control group；aP<0.001 compared with control group；bP<0.001 compared with LPS model group

A.siRNA干扰48 h后，采用蛋白质印迹Western blot法检测Src激酶表达水平；B.干扰Src激酶表达后，采用ELISA法检测各组TNF-α释放量

A.the expression of Src after Src siRNA transfection for 48 hours was determined by Western blot；B.the release of TNF-α after Src siRNA transfection was analyzed by ELISA

图 2 siRNA干扰Src激酶后LPS诱导的神经炎症水平变化

Fig 2 Src siRNA interference affects neuroinflammation level in BV2 cells

p-PTEN：磷酸化磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白；1：对照组；2.LPS模型组；3：Src siRNA+LPS组；4：Src siRNA干扰组；与对照组比较，aP<0.001；与LPS模型组比较，bP<0.001

p-PTEN：phospha-phosphatase and tensin homology protein；1：control group；2：LPS model group；3：Src siRNA+LPS group；4：Src siRNA interference group；aP<0.001 compared with control group；bP<0.001 compared with LPS model group

A.采用蛋白质印迹Western blot法检测各组PTEN磷酸化水平；B.采用蛋白质印迹Western blot法检测各组Akt磷酸化水平A.the expressions of PTEN and p-PTEN were analyzed by Western blot；B.the expressions of Akt and p-Akt were analyzed by Western blot

图 3 干扰Src激酶后PTEN和Akt磷酸化水平变化

Fig 3 Src siRNA interference affects PTEN and Akt phosphorylation

讨 论

炎症反应是机体抵御感染和损伤的复杂的级联过程。长期以来人们一直认为中枢神经系统是免疫豁免区，由于血脑屏障的存在，外周的免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞等无法进入脑内介导炎症反应。后来研究者们发现，脑内的小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等功能与外周免疫细胞相似，被激活后分泌细胞因子介导脑内神经炎症的发生[6]。有报道神经炎症在帕金森氏病、阿尔兹海默病和多发性硬化等多种神经退行性疾病的发病过程中均发挥重要的作用[7]。因此，研究神经炎症相关靶点及通路成为近年神经退行性疾病机制研究中的热点之一。然而临床上暂无针对神经炎症的治疗药物，根本原因是尚未找到合适的靶点。有报道抑制Src激酶的活性可以抑制多种帕金森氏病动物模型脑内的小胶质细胞活化[8- 9]，从而发挥神经保护作用，也可减轻阿尔茨海默病转基因小鼠脑内神经炎症反应及认知障碍[10]。然而其具体机制尚不清楚。研究表明在肿瘤细胞中，Src激酶可通过PTEN蛋白调控Akt信号通路从而调节细胞的增殖[11]。Akt信号通路参与细胞内多种生理过程，与细胞的生长、增殖及免疫有着密切关系[12]。Akt信号通路激活后，可通过增强核转录因子-κB信号通路中抑制蛋白核转录因子抑制蛋白κB激酶核转录因子抑制蛋白κBα的磷酸化及降解，进而导致核转录因子-κB信号通路的激活，而NF-κB是一种转录蛋白，几乎存在于所有细胞中，能够调节多种炎症和免疫基因的表达[13]。因此，Akt信号通路与炎症密切相关。

本研究显示，当小胶质细胞中的PTEN被抑制后，LPS诱导的炎症反应进一步增加，表明PTEN在调控神经炎症中发挥作用。而Src激酶的表达被干扰后，LPS引起的炎症反应减少，表明Src激酶对炎症反应也有调控作用。另外，本研究显示PTEN位于Src激酶的下游，Src激酶对炎症的调节作用可能是通过对PTEN及Akt通路的调控实现的。

综上，本研究提示Src激酶可能是通过对PTEN活性的调控从而调节小胶质细胞中的炎症反应，为Src激酶抑制剂以及神经退行性疾病治疗药物的研发提供理论依据。

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Mechanism of Non-receptor Tyrosine Kinase Src Regulating Neuroinflammation Through Phosphatase and Tensin Homology Protein in Microglia

CAO Shengnan，YU Wenwen，ZANG Caixia，BAO Xiuqi，SUN Hua，ZHANG Dan

State Key Laboratory of Natural Products and Functions，Institute of Materia Medica，CAMS and PUMC，Beijing 100050，China

ZHANG Dan Tel：010- 63165178，E-mail：danzhang@imm.ac.cn

Objective To investigate the mechanism of non-receptor tyrosine kinase Src regulating neuroinflammation through phosphatase and tensin homology protein(PTEN)in microglia.Methods BV2 cells were incubated with PTEN inhibitor bpv(HOpic)for 2 hours，and then added with lipopolysaccharide(LPS)to induce neuroinflammation，Western blot was performed to determine the expression of phosphorylated protein kinase B(Akt)to investigate the activity of PTEN.Enzyme-linked immunosorben assay(ELISA)was used to determine the release of tumor necrosis factor α(TNF-α)to assess neuroinflammation.After PTEN inhibitor or Src specific small interfering RNA was added，the change of neuroinflammation was evaluated to study the mechanism of Src regulating neuroinflammation.Results LPS induced significant neuroinflammation in BV2 cells，as indicated by significantly increased expression of p-Akt and release of TNF-α(P<0.001).The PTEN inhibitor signficantly increased Akt phosphorylation(P<0.05)and TNF-α release(P<0.001)in LPS-induced BV2 cells compared to simply LPS-induced cells.The Src small interfering RNA significantly decreased the release of TNF-α(P<0.001)and inhibited PTEN(P<0.001)and Akt(P<0.001)phosphorylation.Conclusion Src kinase may regulate neuroinflammtion response in BV2 cells by regulating the phosphorylation of PTEN.

Src kinase；neuroinflammation；microglia；phosphatase and tensin homology protein

534-538

张 丹 电话：010- 63165178，电子邮件：danzhang@imm.ac.cn

R96

A

1000- 503X(2017)04- 0534- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.04.012

2016- 04- 25)