真菌发酵虻虫活性物质提取、分离及含量测定

王立娜，刘春雨，王 颖，王集会

(1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2. 山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

真菌发酵虻虫活性物质提取、分离及含量测定

王立娜1，刘春雨1，王 颖1，王集会2*

(1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2. 山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

通过超声水提法提取发酵虻虫干粉中水溶性总蛋白，利用改良Lowry法测定其含量；并采用80%乙醇回流提取的方法提取总黄酮，并通过石油醚、乙酸乙酯分别萃取，同时通过NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定发酵虻虫粉不同极性部位中总黄酮的含量。结果表明发酵后虻虫粉中水溶性总蛋白的平均含量高达99.3140mg/g，而在醇提物中水部总黄酮含量明显高于石油醚部和乙酸乙酯部。

发酵；虻虫干粉；超声水提；醇提；含量对比

虻虫又称牛蜢，牛虻，属虻科昆虫复带虻(Tabanrrs bivittatus Mats)昆虫的雌性干燥全体。中药虻虫是一味传统的活血散瘀类中药。《神农本草经》[1]记载：“蜚虻味苦微寒，主逐瘀血，破下血积，坚痞，癥瘕，寒热，通利血脉及九窍”。现在主要作为中药成方制剂如大黄庶虫丸之原料，治疗冠心病，心绞痛[2]等病症。随着虻虫药用价值的不断开发和研究，有研究发现虻虫在抗凝血[3]及抗肝癌[4]方面有较好疗效。利用球孢白僵菌(Beauveria bassiana (Bals.) Vuill)作为发酵菌，虻虫作为发酵基质，利用基质中所含有的丰富的氮源、碳源、微量元素、矿物质等真菌生长所需的物质，在一定的温度、湿度、时间等条件下，经过白僵菌、虻虫中所含有的物质的相互作用和一系列的生物转化过程，虻虫的大蛋白会被真菌产生的蛋白酶酶解成小分子的具有更强抗肿瘤、抗病毒活性的成分，同时，白僵菌在生长的过程中也会产生大量的次生代谢物质，其中最具代表性的是黄酮类、聚酮类物质，经研究表明其具有明显的抗肿瘤和抗病毒[5]的疗效。将发酵后虻虫粉的水提液进行蛋白质含量的测定，而醇提液则依次通过石油醚、乙酸乙酯进行萃取，不同的极性部位分别进行总黄酮测定，找出丰度最高的部位为下一步发酵虻虫的药理及临床应用打下基础。目前国内外对发酵虻虫蛋白质和黄酮类化合物的研究未见资料报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

芦丁标准品(CHENGDU MUST BIO-TECHNOLOGY CO,LTD.)、牛血清蛋白(BSA，国药集团化学试剂有限公司)、福林酚(国药集团化学试剂有限公司)、酒石酸钾、无水硫酸铜、氢氧化钠、碳酸钠、六水氯化铝、亚硝酸钠乙醇、皆为分析纯。

1.1.2 仪器

TDZ5-WS台式多管低速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)；FA1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；UV9100B型可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)； KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 发酵虻虫粉的制备

精密称取一定量的虻虫干粉，灭菌，同时加入适量的活的球孢白僵菌孢子粉，然后在孢子粉中加入较少量表面活性剂吐温-80，并按一定比例用灭菌水将其稀释成含有1×108个孢子的混悬液，拌匀润湿，控制温度25～28℃以及湿度为95%的培养条件下，在恒温恒湿培养箱中发酵7天左右，等长满发酵白色菌丝后即停止发酵，灭活，冷冻干燥即得发酵物。

1.2.2 发酵虻虫粉中水溶性总蛋白和总黄酮的提取

1.2.2.1 水溶性总蛋白的超声提取

精密称取发酵虻虫粉1.0000 g至100 mL烧杯中，向烧杯中加入15 mL蒸馏水使其溶解，并超声提取10 min，滤过，取其上清液，重复上述步骤两次,去掉残渣。将三次上清液混合转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，混匀，静置。

1.2.2.2 不同部位的总黄酮提取液的制备

精确称取发酵虻虫粉10.0000 g，按料液比1：25加入定量80 %乙醇，超声提取20 min后，将溶液倒入500 mL圆底烧瓶中，在80 ℃水温条件下，回流1.5 h，将黄酮粗提液抽滤，弃去残渣，收集滤液，旋蒸挥去乙醇，浓缩成浸膏，加入浸膏量10倍的蒸馏水混悬，然后加入浸膏料液比1:10的石油醚，萃取3次，静置分层，收集石油醚部并量取其体积及收集水部，将水部加入相同量的乙酸乙酯，萃取3次，静置分层，收集乙酸乙酯部量取体积，收集水部，量取其体积。

1.2.3 Lowry法测定发酵虻虫粉中水溶性总蛋白含量[6]

1.2.3.1 碱性铜溶液的制备

分别量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液 0.5 mL，4 %碳酸钠溶液与溶液各25mL，摇匀，即得，使用时要现用现配。

1.2.3.2 标准牛血清蛋白溶液的制备

精密称取0.0200 g牛血清蛋白于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，静置，即得200 μg/mL的标准牛血清蛋白溶液。

1.2.3.3 标准曲线的制备

分别用移液枪精密量取标准牛血清蛋白质溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置于试管中，并编号，然后补加蒸馏水至1 mL，立即加入碱性铜溶液5 mL，摇匀，室温放置10 min后，快速加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀后室温放置30 min，显色后，以水作空白对照，并于650 nm波长处测定各样品吸光度。以标准蛋白质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到直线回归方程，见图1。

1.2.3.4 发酵虻虫粉中水溶性总蛋白含量的测定

用移液枪吸取2 mL发酵虻虫粉水提液于10 mL容量瓶中，定容，摇匀后吸取1 mL置试管中，按照1.2.3.3项下方法，自"加碱性铜溶液5 mL"起，测定其吸光度，通过标准曲线计算出供试品溶液中所含蛋白质的质量(mg)。分别测量三次，取平均值，见表1。

1.2.4 NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定发酵虻虫粉中总黄酮的含量[7]

1.2.4.1 芦丁标准品溶液的配制

精密称取芦丁对照品20 mg，用60 %乙醇溶解后，转移到100 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，即为浓度为200 μg/mL的标准溶液，放置在4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4.2 标准曲线的绘制

分别用移液枪吸取标准液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL试管中，补加30 %乙醇至5 mL，迅速加入5 %的亚硝酸钠溶液300 μL，摇匀后静置6 min；然后加600 μL 10 %的六水氯化铝溶液，5 min后，加入2 mL 1.0 M的氢氧化钠溶液，再用30 %乙醇补加至刻度。然后在510 nm波长处测定吸光度，以芦丁吸光度(Y)对质量浓度(X)进行回归分析，制作标准曲线，得到直线回归方程，见图2。

1.2.4.3 发酵后虻虫粉中总黄酮含量的测定

精密吸取不同部位发酵虻虫粉黄酮提取液2 mL于试管中,按照1.2.4.2项下方法，自"加30 %乙醇至5 mL"起，依次测定吸光度，通过回归方程求得待测样品溶液中总黄酮的质量(M)。分别测量三次，取平均值，见表2。

2 结果与分析

1.1 蛋白质标准曲线结果如图1。

图1 蛋白质标准曲线

1.2 发酵虻虫水溶性蛋白质含量如表1。

表1 水溶性蛋白质含量 mg/g

1.3 黄酮标准曲线如图2。

图2 黄酮标准曲线

1.4 不同极性部位黄酮含量

不同极性部位黄酮含量见表2。

表2 不同极性部位黄酮含量 mg/g

水部黄酮含量最高，乙酸乙酯部次之，石油醚部最少，说明不同极性部位总黄酮含量存在差异，其在极性大的水和乙酸乙酯中溶解度较大，而在低极性石油醚中基本不溶解。

3 讨论生物转化技术是药性真菌发酵炮制中药的最新应用，本实验以中药虻虫粉为培养基，添加适量的球孢白僵菌，进行发酵炮制。利用酶强大的分解转化能力，对虻虫粉中的蛋白质、黄酮加以利用，从而在代谢过程中转化修饰，提高虻虫粉中活性成分的药效作用，而且通过本实验可以得知发酵后的虻虫粉中含有大量的蛋白质，但是与发酵前相比蛋白质含量是否有所增加，以及对其活性成分——黄酮在每个部位的抗肿瘤活性将是我们下一步的研究工作。

[1] 姜 波,赵荣国,高示贤,等.虻虫的本草考[J].证现代应用药学,1992,9(3):112.

[2] 李军德. 中药虻虫研究进展[C]// 中国中西医结合学会中药专业委员会.2009年全国中药学术研讨会论文集.[出版地不祥]：[出版者不祥], 2009:5.

[3] 梁进权,宓穗卿,王宁生.水蛭、虻虫配伍的抗凝血和抗血小板聚集的作用[J].中药材,200932(9):1347-1350.

[4] 周志愉,余 功,饶 斌,等.破血逐瘀中药虻虫对荷H22肝癌小鼠内皮生长因子及MMP-9蛋白表达的影响[J].广州中医药大学学报,2016,33(2):224-228.

[5] 蒋 学.白僵蚕活性成分分离纯化及其药理作用的研究[D].杭州：浙江大学,2013.

[6] 王立娜, 马明珠, 王 颖, 等. 中药土鳖虫发酵前后活性成分的含量对比[J].湖南中医杂志, 2016, 32(8): 200-202.

[7] 王立娜,马明珠,王集会. 发酵土鳖虫总黄酮含量的测定及方法学考察[J].安徽农业科学,2016,44(21):95-97.

(本文文献格式：王立娜，刘春雨，王 颖.真菌发酵虻虫活性物质提取、分离及含量测定[J].山东化工，2017，46(06)：82-83，88.)

The Active Ingredients of Extraction, Separation and Determination for the Fermented Tabanid by Fungus

WangLina1,LiuChunyu1,WangYing1,WangJihui2*

(1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Experiment Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355, China)

To extract the total soluble protein by ultrasonic for the fermented tabanid of fungus . And using the improved Lowry method to determine the content of tabanid . and using the method of 80% ethanol to extract total flavonoids . Then to determine the extractive of petroleum ether, ethyl acetate of total flavonoids of the fermented tabanid different polar parts table by using NaNO2-AlCl3-NaOH colorimetric method. The results showed that the average content of total water-soluble protein after fermentation as high as 99.3140 mg/g , while the total flavonoids content in the ethanol extract was significantly higher than that in the petroleum ether and ethyl acetat.

fermentation; tabanid; ultrasonic extraction; ethanol extraction; content comparison

2017-02-15

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(项目编号：2016052)

王立娜(1996—)，女，本科在读，研究方向制药工程；通讯作者：王集会(1962—)，副教授，研究方向：虫类中药发酵及活性成分研究。

R284

A

1008-021X(2017)06-0082-02