二茂铁基罗丹明B 荧光探针的合成及其对Hg2+的识别研究

方雪颖，欧阳婷，刘 月，袁艳琴

(丽水学院化学化工系，浙江 丽水 323000)

二茂铁基罗丹明B 荧光探针的合成及其对Hg2+的识别研究

方雪颖，欧阳婷，刘 月，袁艳琴*

(丽水学院化学化工系，浙江 丽水 323000)

以二茂铁甲酸和氨基硫脲环化反应得到2-氨基-5-二茂铁基-1,3,4-噻二唑，再与罗丹明B酰氯胺化得到二茂铁基罗丹明B衍生物R，采用1H NMR、13C NMR及ESI-MS对其结构进行了验证。研究结果表明，化合物R作为荧光探针能选择性地识别Hg2+，且受常见金属离子的干扰较小。探针R 的荧光强度与Hg2+浓度(5×10-7～2.5×10-6mol/L)呈良好的线性关系，并在Hela活细胞中实现了Hg2+的成像。

二茂铁；荧光探针；罗丹明B；汞离子；细胞成像

随着我国经济的快速发展，环境污染问题也随之日趋严重，尤其是重金属污染，使人们的生存环境风险急剧增大。汞是最常见的重金属污染源之一，而且环境中的汞盐可以被微生物转化为甲基汞，并进一步通过食物链被人体吸收，从而对人类健康造成损害[1-3]。因此, 发展选择性高、灵敏度好的检测和识别Hg2+的方法具有重要的意义。近几年，荧光分析法由于其具有检测灵敏度高(可实现单分子检测)、选择性好、成本低、易操作、适用面广，并可以对细胞内金属离子实现原位和成像分析等特点，已被广泛应用于各种金属离子的检测，成为环境分析和生命科学领域的研究热点之一[4-7]。由于自旋轨道耦合效应，Hg2+对荧光团具有猝灭作用，而罗丹明衍生物具有大摩尔消光系数，高突光量子产率和位于可见光区域的长吸收和发射波长等优点，是一种公认的理想荧光增强型荧光分子探针。目前基于罗丹明结构的高选择，高灵敏的Hg2+的探针已有较多报道[8-12]。但其中许多仍然存在一些不足，例如灵敏度低、易受其它金属离子的干扰(尤其是Cu2+, Ni2+, Cr3+和Fe3+)，并且较大一部分的探针只能在有机溶剂例如乙腈溶液中起作用，这使得它们很难在体外和活体实验中被使用。因此，本论文设计合成了一种基于二茂铁基的罗丹明B 类Hg2+荧光探针X(图1)。研究表明，化合物R不仅对Hg2+具有高的选择识别能力，且受常见金属离子的干扰较小；而且，这种增强型荧光探针具有很好的膜透性，我们成功的把它应用于在荧光显微镜下Hela细胞中Hg2+的水平的检测。探针化合物R 的合成路线如图1 所示。

图1 R 的合成

1 结果与讨论

1.1 分子的设计与合成

罗丹明氧杂蒽类荧光探针的螺酰胺环独特的开闭环结构是理想的“OFF-ON”荧光开关模型，是设计荧光增强型探针的理想结构。另外，噻二唑基团可以提高探针分子与过渡金属离子的键合能力，增强探针选择性，并使使螺环打开产生荧光。因此，本文在罗丹明B 结构中引入二茂铁噻二唑基团，设计了目标化合物R。R 的合成路线如Scheme 1 所示，首先合成2-氨基-5-二茂铁基-1,3,4-噻二唑，然后与罗丹明B酰氯反应得到新型罗丹明B 衍生物R。该反应条件温和、后以为原料，处理简便、产物收率高。

1.2 化合物R 对金属离子的选择性识别

为了测定化合物R 对金属离子的识别性能，在10mmol/L HEPES/EtOH (V/V=4/6, pH值=7.0)溶液中，通过荧光光谱检测化合物R 对金属离子(Hg2+、Fe3+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ni2+、Cr3+、Mn2+、Ca2+、Li+、Cd2+和Cu2+)的选择性识别，结果如图2和3 所示。从图2和3 可以看出，在未加入金属离子或者加入Fe3+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ni2+、Cr3+、Mn2+、Ca2+、Li+、Cd2+、Cu2+时，溶液显示无色，几乎没有荧光发射，说明R主要以螺环的形式存在；而加入Hg2+后，在最大发射波长582 nm 处荧光发射明显增强，溶液的颜色由无色变成粉红色，这可能是由于Hg2+诱导电子发生转移导致螺环结构开环。由此可见，裸眼即可定性的检测溶液中是否含有Hg2+。

图2 (a)探针R 对金属离子的颜色变化及(b)探针R 对金属离子的荧光变化

Fig.2 The colorimetric (a) and fluorometric (b) changes of R (10 μmol/L) upon addition of Hg2+(50 μmol/L) and other cations(50 μmol/L) in 10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V=4/6, pH值=7.0) solution (note: The two photos were obtained in normal light (a) and upon at 365 nm using UV lamp (b), respectively)

图3 R (10 μmol/L)对金属离子(20 μmol/L)的选择性

Fig.3 Fluorescence spectra of probe R (10 μmol/L) to different metal ions (20 μmol/L)

进一步考察了其它金属离子和Hg2+共存时对Hg2+测定的影响。所有离子的浓度均为20 μmol/L, 黑色柱状图代表在Hg2+存在时加入不同的金属离子。从图4中可以看出，共存离子存在下，探针R 对Hg2+识别的荧光强度基本保持不变，说明探针R 对Hg2+识别具有较强的抗干扰能力。因此，化合物R 是一个高选择性的荧光增强型Hg2+探针。

图4 其他金属离子和Hg2+ (20 μmol/L)

Fig.4 Fluorescence intensity changes of R (10 μmol/L) upon the addition of different metal ions (20 μmol/L) in and without the presence of Hg2+(20 μmol/L) of different ions reacting to probe R. From left to right 20 μmol/L of (1) Fe3+, (2) Co2+,(3) Mg2+,(4) Zn2+,(5) Al3+, (6) Na+, (7) Ni2+, (8) Cr2+,(8) Mn2+,(10) Ca2+,(11) Li+,(12) Cd2+,(13) Cu2+,(14) Hg2+(black bars: R with different ions, red bars: R with Hg2+and other metal ions)

1.3 不同浓度Hg2+对化合物R 荧光光谱的影响

在10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V=4/6, pH值=7.0)溶液中测定了在不同Hg2+浓度下化合物R 的荧光发射光谱，如图5 所示。在化合物R 的最大发射波长(582 nm)处，随着Hg2+浓度的不断增大，溶液的荧光强度也不断的增加，这表明化合物R 和Hg2+有良好的结合作用。

进一步的研究结果(如图6 所示)表明，Hg2+浓度在5.1×10-7～2.5×10-6mol/L 范围内与探针R 的荧光强度呈良好的线性关系，曲线方程为y=-17.9+69.7x，相关系数R2=0.99118，表明化合物R 可以定量地检测此范围内的Hg2+含量。

图5 R (10 μmol/L)中逐渐加入Hg2+(0～5.5 equiv.)的荧光发射变化曲线图

图6 R 的荧光强度随Hg2+浓度(0.5×10-7～2.5×10-7 mol/L)变化的线性关系图

1.4 络合机理解释

处于500～650nm处的紫外吸收峰是一个罗丹明螺环打开的明显特征。L-Hg2+在582nm处产生了紫外吸收如图3及图5所示，我们认为当探针L的溶液中加入Hg2+后产生的荧光增强，是由于Hg2+罗丹明B络合后使螺环打开产生了荧光，这与一般的基于罗丹明结构的Hg2+荧光探针没有差别(图7)。

图7 R 识别Hg2+的可能机理

1.5 化合物R 对细胞中Hg2+的荧光成像实验

在细胞成像实验中，将10 μmol/L 探针R 溶液加入到育有Hela细胞的培养液中孵化，在37 ℃的二氧化碳培养箱中培养1h，用PBS 缓冲溶液洗去细胞外的残余探针R，用荧光显微镜进行观察，细胞没有荧光信号产生(图8a)。当在Hela细胞的培养介质中加入10μm的Hg2+孵化0.5h，然后再加入探针L 孵化2h后，在相同的测试条件下，再次成像发现活细胞发出了红光的荧光(图8b)，这表明探针R 具有良好的细胞渗透性，可以对活细胞内的Hg2+进行荧光成像。当孵化时Hg2+浓度的增加至20μm，细胞内的荧光强度随之增强，这样结果表明L对汞离子的检测在活细胞内的剂量依赖性(图8c)。

(a) Fluorescence images of Hela cells treated with R (10 μmol/L);(b) Fluorescence images of Hela cells incubated with R (20 μmol/L), then further incubated with Hg2+(10 μmol/L) for 2 h;(c) Fluorescence images of Hela cells incubated with R (20 μmol/L) , and further incubated with Hg2+(20 μmol/L) for 2 h

图8 R 在Hela细胞中对Hg2+的荧光成像

Fig.8 Fluorescence images of Hg2+in Hela cells with R

2 结论

本文以罗丹明B 为荧光基团，二茂铁基噻二唑片段为识别基团设计合成了一种新型的Hg2+荧光探针化合物R，并对其进行了结构表征。在10 mmol/L HEPES/EtOH(V/V=4/6, pH值=7.0)溶液中，探针R 可以选择性识别Hg2+。在Hg2+浓度(5.1×10-7～2.5×10-6mol/L)范围内，其荧光强度和Hg2+浓度具有良好的线性关系，可在此范围内定量地检测Hg2+的含量。另外，R在Hela活细胞中实现了Hg2+的荧光成像,对生物体活细胞内Hg2+检测具有一定的指导意义。

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

Brucker AVANCE II 300 MHz 核磁共振仪(DMSO为洛剂，TMS为内标；X-4型数字显微熔点测定仪，Thermo LXQ 液相色谱离子阱质谱联用仪(美国Thermo公司)，CaryEclipse 荧光分光光度计(澳大利亚瓦里安有限公司)。

所有试剂均为市售分析纯，实验所用的水均为去离子水。

3.2 5-二茂铁基噻二唑罗丹明B的合成

3.2.1 2-氨基-5-二茂铁基-1,3,4-噻二唑的合成

将二茂铁甲酸(60mmol)和氨基硫脲( 78mmol)加入盛有80mL POCl3的250mL圆底烧瓶中，搅拌并加热到60℃保持2h，然后加热到回流反应4h后停止反应。冷却至室温。将溶液慢慢倒入盛有冰的烧杯中，搅拌至有泡沫产生，然后在0℃冰水浴中，用稀的NaOH溶液调节pH值 8～9。析出固体抽滤，粗产品用柱层析法提纯(展开剂为乙酸乙酷)，然后用乙醇重结晶，得到橙黄色固体，产率16.5%。m.p. 186～187℃；1H MNR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.16 (s, 2H; N-H), 4.72 (t, J=1.8Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.41 (t, J=1.8 Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.15(s, 5H; Ferrocene-H). HRMS (EI): m/z(%):calcd for [M+H]+C12H12FeN3S+: 286.0101 found: 286.0094。

3.2.2 2荧光探针L的合成

将罗丹明B盐酸盐(0.479g g，1 mmol ) 1,2-二氯乙烷( 15mL)和POCl3( 5mL )加入100mL圆底烧瓶中加热回流4h，然后将反应完的混合体系减压蒸馏，得到的罗丹明酰氯。将其溶解于干燥的二氯甲烷(15mL)中，再向其中加入三乙胺(3mL)作为缚酸剂，将2-氨基-5-二茂铁-1,3,4-噻二唑( 0.342g，1.2mmol)加入其中，在氮气保护下常温搅拌反应24 h。粗产品通过柱层析法提纯(展开剂为石油醚/乙酸乙酯= 3:1, V/V )，再通过乙醇重结品后得到最终产品为橙黄色固体，产率17.6%(m.p.262～264℃)；1H MNR (300 MHz, DMSO-d6): δ 8.05 (d, J=7.2Hz, 1H; Ar-H), 7.74-7.63 (m, 2H; Ar-H), 7.17 (d, J=7.5 Hz, 1H; Ar-H), 6.38 (t, J=3.45Hz, 2H; Ar-H), 6.34 (s, 2H, Ar-H), 6.26-6.22 (m, 2H; Ar-H), 4.80 (t, J=1.8 Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.48 (t, J=1.8 Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.11 (s, 4H; Ferrocene-H), 3.34-3.26 (m, 8H; CH2), 1.07 (t, J=6.9 Hz, 12H; CH3);13C NMR (75 MHz,DMSO-d6 ppm): δ 166.6, 163.9, 154.5, 164.0, 149.4, 136.2, 130.2, 128.5, 128.0, 125.5, 124.4, 108.5, 106.0, 98.1, 75.1, 71.1, 70.8, 69.2, 68.5, 44.5, 13.4; IR (KBr): 3084.8, 2971.1，2892.5, 2867.0, 1699.6, 1613.5, 1515.6, 1480.8, 871.8, 823.4, 710.3 cm-1; MS (EI): m/z(%): calcd for [M+H]+C40H40FeN5O2S+: 710.2252, found: 710.2272。

3.3 荧光光谱的测定方法

将探针R用乙醇配成 1×10-3mol/L 的溶液，金属盐用去离子水配成1×10-3mol/L 的溶液。移取探针R溶液0.1 mL 置于10 mL 容量瓶中，移取金属盐溶液0.2mL 加入容量瓶中，再用10 mmol/L HEPES/EtOH(V/V=4/6, pH值=7.0)缓冲溶液定容，震荡使其混合均匀，得到测试溶液中探针浓度为10 μmol/L，金属盐溶液浓度为20 μmol/L。进而测定其荧光发射光谱(选择性、竞争性、浓度梯度、Job 曲线等)及pH对探针分子荧光发射光谱的影响，pH值由1 mol/L HCl 和NaOH 调节。测试条件：在室温下，将待测溶液装入1 cm × 1cm × 4 cm 的石英比色皿中，激发波长(λ)为530 nm，扫描540～750 nm 范围内的荧光光谱。

3.4 细胞培养和成像

Hela细胞在含有10%的牛血清、潮湿空气(含有5%CO2)的是在DMEM培养基( Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco )中进行培养。荧光成像过程是将5×104mL-1的细胞接种到24个孔板中；检测Hg2+的实验是在相同的培养基中加入10 μm或者20 μm的HgCl2，放置孵化细胞1h。细胞染色实验前先用PBS洗两遍，然后再加入10 μm的探针L放置在培养器中1.5 h。用PBS洗涤两次后，细胞在相差显微镜下进行荧光成像。

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(本文文献格式：方雪颖，欧阳婷，刘 月，等.二茂铁基罗丹明B 荧光探针的合成及其对Hg2+的识别研究[J].山东化工，2017，46(08)：36-39.)

A Novel Rhodamine B Fluorescent Probe for Hg2+: Synthesis and Evaluation

FangXueying,OuYangting,LiuYue,YuanYanqin*

(Department of Chemistry, Lishui University, Lishui 323000)

A novel rhodamine B fluorescent probe R was synthesized by the amination of rhodamine B with 5-ferrocenyl-1,3,4-thiadiazol-2-amine which obtained by cyclization of ferrocenecarboxylic acid and thiourea, and its structure was characterized by1H NMR,13C NMR, and ESI-MS. It exhibited very strong fluorescence responses to Hg2+with remarkably high selectivity for Hg2+over other metal ions. When the concentration of Hg2+was in the range of 5×10-7～2×10-6mol/L, there was a good linearity between the fluorescence intensity and the concentration of Hg2+. The fluorescence imaging experiments of Hg2+in Hela living cells revealed its potential application in biological system.

ferrocene; fluorescent probe; rhodamine B; mercury ion; cell imaging

2017-02-21

浙江省丽水市公益性技术应用项目(2014JYZB49)，2016年浙江省大学生科技创新项目

方雪颖(1998—), 女, 浙江杭州人, 本科；通信作者: 袁艳琴( 1977—), 女, 江西樟树人, 主要从事有机合成方法学的研究。

O657.3

A

1008-021X(2017)08-0036-04