粤北地区仔猪腹泻大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

黄健强， 南文金*， 胡鸿惠， 吴静波， 彭国良， 肖正中

(1.韶关学院 动物疫病实验室，广东 韶关 512005； 2.韶关学院 英东农业科学与工程学院，广东 韶关 512005；3.粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，广东 韶关 512005)

粤北地区仔猪腹泻大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

黄健强1，3， 南文金1，3*， 胡鸿惠1，3， 吴静波1,3， 彭国良2,3， 肖正中2,3

(1.韶关学院 动物疫病实验室，广东 韶关 512005； 2.韶关学院 英东农业科学与工程学院，广东 韶关 512005；3.粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，广东 韶关 512005)

为了解粤北地区规模化猪场仔猪腹泻大肠杆菌耐药情况，为该病防控提供用药参考，对来自6个规模化猪场疑似仔猪大肠杆菌引起的腹泻粪便和肠道内容物进行了大肠杆菌分离鉴定，对分离鉴定的40株大肠杆菌进行了药敏试验。结果表明，分离菌株对22种受试药物均产生不同程度耐药性，强力霉素和四环素耐药菌株比例最高，达到97.5%，其次是复方新诺明、庆大霉素、氯霉素和红霉素耐药菌株达到80%以上。敏感性最高的药物为丁胺卡那霉素，其次是头孢西丁，敏感菌株比例分别为85%和84.5%。试验菌株均产生不同程度多重耐药性，最少为4重耐药性，10重及以上耐药性菌株比例达到80%以上。研究表明，粤北地区仔猪腹泻大肠杆菌耐药性严重，要重视药敏监测，以指导合理选用药物防控该病。

仔猪；腹泻；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种传染病，是养猪生产中最常见的一类细菌性疾病。大肠杆菌是一种条件性致病菌，在养猪生产中多因阴冷潮湿、保温不好、温差过大、转群换料导致仔猪发病和死亡。大肠杆菌引起的仔猪腹泻因发病日龄不同临床症状不同，仔猪黄痢主要发生在7日龄内新生仔猪，仔猪白痢主要发生在一周到断奶哺乳仔猪，还有一种大肠杆菌引起的腹泻主要发生在断奶后仔猪[1]。猪场一旦发生仔猪腹泻，特别是新生仔猪黄痢和仔猪白痢，如果控制措施不科学及时，往往导致疫病在母猪分娩舍传播，导致仔猪大批死亡，损失严重。在养猪生产中，由于抗生素的不规范和盲目使用，导致细菌耐药谱不断扩大[2]，给猪大肠杆菌病的治疗和控制带来困难。为了解粤北地区仔猪大肠杆菌耐药现状，本研究从粤北地区6个规模化猪场采集了发生腹泻的仔猪粪便和肠道内容物，分离鉴定了大肠杆菌40株，并进行了22种常见药物的敏感性试验和分析，旨在为该地区猪大肠杆菌病临床用药及细菌耐药性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 猪大肠杆菌菌株自粤北地区疑似仔猪大肠杆菌腹泻样品中分离鉴定；大肠杆菌质控菌株ATCC25922为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养肉汤为广东环凯微生物科技有限公司产品；2×PCR Mix、DL 2 000 分子量标准为广州东盛生物科技有限公司产品；PCR引物由宝生物(大连)生物工程有限公司合成；药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离和纯化 采集发生黄痢和白痢仔猪粪便和肠道内容物，在麦康凯培养基平板上划线接种，37 ℃恒温培养16～18 h，挑取呈红色单个菌落接种到伊红美蓝培养基平板上，37 ℃培养16～18 h，挑取呈黑色带金属光泽单个菌落进行革兰染色、镜检，符合大肠杆菌染色特性的菌落接种于营养肉汤中，37 ℃摇床培养12～16 h。

1.2.2 生化试验 将营养肉汤中扩大培养的新鲜菌液分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖发酵管中培养24 h，同时进行吲哚试验、甲基红(M.R.)试验、V-P试验和枸橼酸盐利用试验。

1.2.3 细菌PCR鉴定 取200 μL营养肉汤培养的新鲜菌液，用煮沸法提取细菌基因组DNA，用大肠杆菌特异性PCR方法进行PCR鉴定，引物为P1: CGATTCTGGAAATGGCAAAAG，P2: CGTGATCAGCGGTGACTATGAC。PCR反应条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，预期扩增片段长度720 bp。

1.2.4 药敏试验 对鉴定为大肠杆菌的菌株进行22种抗菌药物的药敏试验。取纯化后培养16 h的菌液200 μL，用玻璃棒均匀涂布于营养琼脂培养基上，放置药敏纸片,37 ℃培养16 h后用游标卡尺测定抑菌圈直径，结果判定按照杭州滨和微生物试剂有限公司纸片法药敏试验抑菌环判断标准进行判定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养与生化鉴定

共分离到在麦康凯培养基上呈红色菌落，在伊红美蓝培养基上呈黑色带金属光泽且为革兰阴性、两端钝圆杆状细菌43株，通过生化鉴定试验，43株疑似大肠杆菌中有40株符合大肠杆菌生化反应特征，即能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇产酸产气；吲哚试验和M.R.试验呈阳性；V-P试验和枸橼酸盐利用试验呈阴性。

2.2 细菌PCR鉴定

生化鉴定为大肠杆菌的菌株经过大肠杆菌特异性PCR扩增，均扩增到长度为720 bp目的条带，见图1。

2.3 药敏试验

40株分离菌株对22种抗菌药物的药敏试验结果见表1，菌株耐药情况统计结果见表2。由表2可知，分离鉴定的40株菌株中，对氨苄青西林、头孢克肟、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、强力霉素、氯霉素、红霉素、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星耐药菌株达到50%以上，其中氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、强力霉素、氯霉素、红霉素和复方新诺明耐药菌株达到70%以上，最高的四环素和强力霉素耐药菌株数占实验菌株的97.5%；高度敏感菌株比例最高为头孢西丁，达到72.5%，其次为头孢类抗菌药物头孢曲松、头孢氨苄、头孢他啶和头孢哌酮以及氨基糖苷类抗菌药物丁胺卡那霉素，高度敏感菌株比例分别为40%、40%、32.5%、30%和40%。

图1 分离杆菌PCR鉴定Fig.1 Isolated strains PCR identification

菌株编号药物名称氨松拉肟罗他链庆卡丁新四强氯红复氟恩环哌肟西1RIRRRRRRRIRRRRIRSIIRRI2RIIRRRRRRIRRRRRRIRIRRS3RSRRRRRRRRRRRRRRIIIIIS4SSRRRRRIRRRRRRRRRIIIRS5RIRRRRRRRIRRRRRRIIRRIR6RRRRRRIRRIRRRRIRRRRRRI7SSISSSIISIIRIRRRSIISSS8RIRRRRIRRSIRRRRRRRRIII9ISIISSSRRSRRRRRRIIISII10RIIRRISRISIRRIRRRRRRSR11SSIISSSSSIIRRISRRRRISS12RSIISSIRRIIRRRIRRRRIIS13RIIIISRRRIRRRRRRRRRIIS

续表1

注：氨：氨苄西林；松：头孢曲松；拉：头孢拉定；肟：头孢克肟；罗：头孢克罗；他：头孢他定；链：链霉素；庆：庆大霉素；卡：卡那霉素；丁：丁胺卡那；新：新霉素；四：四环素；强：强力霉素；氯：氯霉素；红：红霉素；复：复方新诺明；氟：诺氟沙星；恩：恩诺沙星；环：环丙沙星；哌：头孢哌酮；肟：头孢呋肟；西：头孢西丁；S：高度敏感；I：中度敏感；R：耐药

表2 大肠杆菌菌株耐药情况统计

续表2

2.4 多重耐药情况

分离的40株大肠杆菌对22种受试药物均产生不同程度的多重耐药性(图2)，所有菌株中耐药谱最窄的也对4种药物表现为耐药，耐药谱最广的菌株对21种药物耐药；产生10重及以上耐药的菌株比例占分离菌株的80%，其中以产生13～15重耐药性的菌株占分离菌株的比例最高，达到32.5%。

图2 大肠杆菌多重耐药性Fig.2 Multi-drug resistance of E.coli

3 讨 论

生化反应是鉴定大肠杆菌的经典方法，鉴定为大肠杆菌的试验菌株通过大肠杆菌特异性PCR方法进行分子鉴定，试验菌株都扩增到目的片段，相比传统的生化反应鉴定，分子鉴定具有速度快、鉴定周期短、不需要纯化培养菌株等优势，可广泛应用于流行病学调查和对疾病快速确诊。

药敏试验结果说明粤北地区猪大肠杆菌耐药性十分严重，在所用的22种药物中，有14种对50%以上的分离菌株有耐药性。耐药性最强的四环素、强力霉素、复方新诺明等抗菌药物，耐药性达到95%以上，几乎没有菌株对这些药物高度敏感。四环素类药物和磺胺类药物因其价格低廉，给药方便，近几年被猪场广泛使用，部分猪场在日常保健中长期使用这类药物，导致耐药菌株不断增加。苏丹萍等[3]2010年对广东部分猪场大肠杆菌药敏试验结果表明，这三种药物的耐药性分别为68.79%、37.93%和89.66%，而本研究药敏试验结果表明，广东地区猪场大肠杆菌对这三种抗菌药物耐药性都进一步增加，特别是强力霉素，几乎失去对大肠杆菌的抗菌作用，应引起行业的重视。

本研究中22种受试药物对分离菌株敏感性(包括高度敏感和中度敏感)较高的分别为头孢西丁、头孢曲松、头孢拉定、头孢他啶、头孢哌酮和头孢呋肟，敏感性菌株占试验分类菌株55%～87.5%。将研究中所用到的8种头孢类药物按代次分类后发现，分离菌株对头孢拉定、头孢氨苄等一代头孢药物耐药性要高于二代和三代头孢类药物，但二代和三代头孢类药物对粤北地区猪大肠杆菌分离株耐药性差别不明显，敏感性最高的两个药物是二代头孢药物头孢西丁和三代头孢药物头孢曲松，敏感菌株分别占分类菌株的87.5%和77.5%。相比2007年至2010年间广东部分猪场大肠杆菌药敏试验结果报道比较，头孢类抗菌药物敏感性均下降[3-4]，与国内其他地区猪大肠杆菌药敏试验报道相比，头孢类药物对猪大肠杆菌敏感性要低于河南、四川、吉林部分地区[5-7]，这可能是由于广东地区规模化养猪程度较高，集约化饲养带来疫病压力增加，猪群预防和治疗用药增加，猪群对头孢类药物敏感性降低，耐药性随之增加。分离菌株对常用药庆大霉素、氨苄西林耐药性超过80%，对头孢类药物和喹诺酮类药物的耐药性增加说明了粤北地区猪大肠杆菌耐药谱不断扩大。丁胺卡那霉素对粤北地区猪大肠杆菌敏感性较高，高度敏感性达到40%，中度敏感性为45%，这与广东省内及省外部分地区相关报道一致。调查发现，头孢曲松、头孢西丁和丁胺卡那霉素这几种耐药率较低的药物价格较高，一般猪场不会用作保健预防用药，而是作为治疗用药使用，很少长期使用，而磺胺类、四环素类、青霉素类药物等价格低廉，常被用作保健预防用药，长期低剂量使用是导致大肠杆菌对这些药物耐药性增加的主要原因之一。

大肠杆菌多重耐药性在各地普遍存在[4-9]，给临床药物选择带来了困扰。本研究分离的40株大肠杆菌表现出多重耐药性严重，最低也能对4种药物产生耐药性，80%分离菌株对10种以上药物产生多重耐药性，其中13～15重耐药菌株比例最高。对来自同一猪场同一时间分离鉴定的仔猪黄痢大肠杆菌药敏结果比较发现，不同菌株之间药敏结果也有一定差异，因此，进行药敏试验时要尽可能收集到较多的病料，分离多个菌株进行药敏试验，选择使用对多个菌株都敏感的药物或联合用药效果更佳。

在药物选择压力下，细菌通过染色体突变、质粒介导、转座子和整合子插入等途径改变遗传物质从而产生耐药性[10-11]，一旦获得对某种抗菌药物的耐药性，这种耐药机制不但会稳定遗传给后代，还可以通过水平转移传播给其他细菌。我国学者最新研究发现一种新的基因(MCR-1)可以使细菌对多粘菌素产生耐药性，这个耐药质粒广泛存在于南方猪群的肠杆菌科细菌中，并且可以在大肠杆菌、克雷伯杆菌以及绿脓杆菌间水平转移[12]，而多粘菌素作为一种抗革兰阴性细菌广谱抗菌药物添加在饲料中使用。抗菌药物的使用对促进集约化养猪生产发挥了重要作用，但随着养猪生产疫病复杂化程度加剧，抗菌药物使用量不断增加，特别是长期低剂量滥用抗菌药物预防疾病，促使细菌耐药性产生和耐药谱不断扩大。抗菌药物的滥用，不但给动物疫病防控带来困扰，而且造成动物源性食品抗生素残留超标。此外，部分代谢不完全的抗生素通过粪尿等途径污染环境，造成土壤和水体抗生素超标[13]。同时，一些人兽共患病病原菌耐药菌菌株通过食物链传递给人类，使人体内产生相同耐药菌，给公共卫生带来了挑战[14]。细菌的耐药谱在不同猪场和地区间都有差异，因此要重视对常见细菌病的耐药性监测，生猪养殖企业要根据本地区、本场致病菌药敏特征选择有效药物进行防治，注意轮换用药，禁止长时间使用一种药物预防疾病，减少因抗菌药物使用不科学而加速细菌耐药性产生。

[1] 斯特劳著. 赵德明, 张仲秋, 沈建忠, 译.猪病学[M]. 北京: 中国农业大学出版社，2008: 723-732.

[2] 赵明秋, 沈海燕, 潘文, 等. 细菌耐药性产生的原因、机制及防治措施[J].中国畜牧兽医, 2011, 38(5): 177-181.

[3] 苏丹萍, 赵彦宗, 陈敏鸿, 等. 广东地区部分猪场大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].畜牧与兽医, 2010, 42(7): 80-82.

[4] 江飙, 董嘉文, 张献杰, 等. 广东地区动物源性大肠杆菌的分离及药敏试验[J].中国兽药杂志, 2009, 43(1): 14-16.

[5] 王克领, 张青娴, 徐引弟, 等. 河南地区猪源性大肠杆菌血清型鉴定与耐药性调查[J].河南农业科学, 2014, 43(9): 164-167.

[6] 舒蕾, 万莉, 张琦, 等. 四川某些规模化猪场大肠杆菌的分离鉴定及耐药性监测[J].中国兽医杂志, 2012, 48(3): 32-34.

[7] 王基伟, 孙洋, 纪雪, 等. 长春地区猪源大肠杆菌的分离和耐药性分析[J].中国兽药杂志, 2014, 48(11): 14-18.

[8] 曾博, 王红宁, 邹立扣, 等. 西南地区猪肠外大肠杆菌毒力基因检测及耐药性研究[J].中国预防兽医学报, 2013, 35(2): 126-129.

[9] 麻延峰, 王宏艳, 严晗光, 等. 金华地区仔猪致病性大肠杆菌的血清型及药敏试验[J]. 浙江农业学报, 2014, 26(6): 1437-1441.

[10]Hunter PA, Reeves DS. The current status of surveillance of resistance to antimicrobial agents: report on a meeting [J]. J. Antimicrob. Chemother, 2002, 49(1): 17-23.

[11]Collis CM, Kim MJ, Part ridge SR, et al. Characterization of the class 3 integron and the site-specific recombination system it determines[J].J Bacteriology, 2002, 184(11): 3017-3026.

[12]Li YY, Wang Y, Walsh RT, et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study[J]. Lancet Ifect Dis, 2016，16(2):161-168.

[13]郭丽, 王淑平. 兽用抗生素在土壤中运移规律研究进展[J].环境科学与技术, 2014, 37(12): 237-246.

[14]张小莺.兽用抗生素的合理使用与替代[J].中国畜牧业,2015, 12: 45-46.

Isolation and Identification ofE.colifrom Piglets Diarrhea and Drug Resistance Analysis in North Guangdong Region

HUANG Jian-qiang1, 3, NAN Wen-jin1, 3, HU Hong-hui1, 3, WU Jing-bo1, 3, PENG Guo-liang2, 3, XIAO Zheng-zhong2,3

(1.Lab.ofAnimalDis., 2.Schl.ofAgric.Sci. &Engin.,ShaoguanUni.,Shaoguan512005; 3.N.GuangdongCollabor.Innovat’n&Devel’tCtr.ofPigFarming&Dis.Ctrl.,Shaoguan512005)

In order to investigate the situation of drug resistant to diarrheaE.colifrom piglets in massive pig farm and provide drug administration references against the disease, a total of 40 strainsE.colithat caused diarrhea isolated from dejection and content of the enteric duct of diarrhea suspected piglets in six massive pig farms in north Guangdong region were identified. The 40 isolated and identified strains were tested for their drug sensitive test, the results showed that all strains had different degrees of drug resistance to 22 tested drugs. They had the highest proportion to resist deoxycycline and tetracycline at 97.5%, followed by compound SMZ, gentamycin, chloramphenicol, and erythromycin with resistance proportion at 80% of the identified bacteria. The most sensitive drug was amikacin followed by cofoxitin, drug sensitive ratio was 85% and 84.5% respectively. All tested strains showed multi-drug resistance, a minimum of 4 multi-drugs resistances, more than 80% isolated strains showed resistant to 10 kinds′ drugs or above. The research showed thatE.coliof diarrhea piglet′s resistant situation was serious in north Guangdong province, and must pay attention to monitoring of drug susceptibility to guide the rational selection of drug prevention and control the disease.

piglets; diarrhea;Escherichiacoli; isolation and identification;drug sensitive test

广东省科技计划项目(2016A040402038)；韶关市科技计划项目(2013CX/N09)；韶关学院科研项目(韶学院[2014]213号)

黄健强 男，兽医师，硕士。主要从事动物疫病检测工作。E-mail:little8strong@163.com

* 通讯作者。男，助理研究员，硕士。主要从事动物疫病防控技术研究。E-mail:nanwenjin@126.com

2016-05-09；

2016-06-26

Q939.94

A

1005-7021(2017)03-0059-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.011