肺癌组织皮层肌动蛋白的表达及对肺癌细胞侵袭、迁移的影响*

龙 谦， 罗 猛， 刘 迪， 刘 波， 胡 剑， 许 川

贵州省人民医院胸外科，贵阳 550002

肺癌组织皮层肌动蛋白的表达及对肺癌细胞侵袭、迁移的影响*

龙 谦， 罗 猛， 刘 迪， 刘 波， 胡 剑， 许 川△

贵州省人民医院胸外科，贵阳 550002

目的 探讨皮层肌动蛋白(Cortactin)在肺癌组织的表达与患者生存预后的关系及对肺癌细胞侵袭、迁移的影响。方法 收集贵州省人民医院50例行肺叶切除术的非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌组织及癌旁组织，免疫组化染色检测肺癌组织Cortactin表达，分析Cortactin表达与肺癌患者临床资料的关系。对肺癌患者进行随访，记录患者5年生存率；以5年生存率作为评价指标，采用单变量和多变量Cox比例风险模型评价患者预后的影响因素。采用小干扰RNA(siRNA)技术抑制肺癌A549细胞Cortactin的表达，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 肺癌组织Cortactin高表达率为72.0%(36/50)，癌旁组织高表达率为24.0%(12/50)，肺癌组织Cortactin高表达率明显高于癌旁组织，两组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。肿瘤最大径≥3 cm组Cortactin高表达率明显高于肿瘤最大径<3 cm组，中高分化组Cortactin高表达率明显高于低分化组，有淋巴结转移组Cortactin高表达率明显高于无淋巴结转移组(均P<0.05)；Cortactin表达与性别、年龄、TNM分期、组织学类型无关(均P>0.05)。Cortactin低表达组5年总生存率为42.1%，高表达组5年总生存率为13.7%，高表达组5年总生存率明显低于低表达组(P=0.018)。Cox多因素分析显示肿瘤直径大、淋巴结转移、高Cortactin表达是影响患者总生存期的独立危险因素(均P<0.05)。划痕实验显示Cortactin-siRNA组细胞迁移率明显小于Cortactin-NC组、Cortactin-BC组；Transwell实验显示Cortactin-siRNA组穿膜细胞数明显少于Cortactin-NC组、Cortactin-BC组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论 Cortactin表达与肺癌患者生存预后有关，抑制Cortactin表达能够降低肺癌细胞的侵袭、迁移能力，Cortactin有望成为肺癌治疗的新靶点。

皮层肌动蛋白； 肺癌； 生存率； 侵袭； 迁移

肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织(WHO)调查显示[1]，肺癌发生率约占全部肿瘤的30%。我国是肺癌高发国家，由于环境因素、不良生活习惯等，肺癌发病率呈明显上升趋势[2]。肺癌的预后较差，复发和远处转移是导致患者死亡率居高不下的主要原因。据相关文献报道[3-4]，约有37%的肺癌患者确诊时存在局部浸润，38%的患者就诊时存在远处转移。近20年来肺癌的诊疗技术得到了极大的提高[5]。因此早期发现肺癌的转移，对提高肺癌的疗效、延长患者生存期具有重要意义。皮层肌动蛋白(Cortactin)是位于染色体11q13的多结构域蛋白，能够与肌动蛋白相关蛋白Arp2/3复合物结合，通过调节肌动蛋白网络分支的形成，诱导细胞形成片状伪足，使细胞获得侵袭、迁移等能力[6]。目前研究证实Cortactin在肝癌和食管癌等实体肿瘤中呈高表达，并与肿瘤细胞的增殖、侵袭等生物学行为有关[7-8]。但是目前尚不清楚Cortactin与肺癌预后及肺癌细胞侵袭、迁移的关系。鉴于此，本研究首先检测Cortactin蛋白在肺癌组织和癌旁组织的表达情况，并进一步采用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术抑制肺癌A549细胞Cortactin的表达，检测细胞迁移、侵袭能力的变化，旨在为肺癌的治疗提供有效的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 样本采集

选择2009年7月至2011年6月贵州省人民医院行肺叶切除术的50例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作为研究对象，将术中切除肺癌组织及配对的癌旁组织(距癌组织边缘>5 cm)用手术剪剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块状，立即置于液氮中保存。病理组织经术后病理检查证实。所有患者术前未接受放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，排除合并其他恶性肿瘤、全身严重感染及凝血功能异常者。对患者临床资料进行收集，包括姓名、性别、年龄、肿瘤体积、分化程度、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移等，其中TNM分期参考美国癌症国际联盟抗癌分期手册(American Joint Committee on Cancer-International Union Against Cancer staging manual)TNM分类系统[9]。本研究经过医院伦理委员会批准，患者术前均被告知研究方案，并自愿签署知情同意书。术后对患者进行定期随访，术后第1年每3个月随访1次，此后每半年随访1次。本研究随访截止时间为2016年12月7日。

1.2 细胞来源及培养

肺癌细胞系A549购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)，A549细胞接种于DMEM培养液(Gibco公司)，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，在培养箱中于37℃、5%CO2中培养。每隔2～3 d更换1次培养液，每隔3 d传代1次，选择传3代以上细胞用于后续实验。

1.3 实验试剂

RIPA裂解液、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自广州碧云天生物技术研究所，Trizol试剂盒、RT-PCR反应试剂盒、脂质体Lipofectamine 2000TM购自美国Invitrogen公司，Cortactin干扰RNA序列委托上海吉凯基因化学技术有限公司合成设计，Cortactin-siRNA序列：5′-CAAGACCGAAUGGAUAAGU-TT-3′，阴性对照(Cortactin-NC)序列：5′-CGUA-UGCGCGUACUCUAAUTT-3′。RNA提取试剂、SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，Transwell小室、Matrigel人工基底膜购自美国BD公司，兔抗人Cortactin多克隆抗体、FITC标记的山羊抗兔荧光二抗购自Santa Cruz公司，聚丙烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸钠购自美国Sigma公司。

1.4 免疫组化染色检测肺癌组织Cortactin表达

样本组织用中性甲醛固定，石蜡包埋。将组织标本制成厚度为4 μm的切片，常规对石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色。切片脱蜡后，将标本在10 nmol/L柠檬酸钠缓冲液中加热至97℃持续20 min，修复抗原；再加入过氧化氢孵育5 min，阻断内源性过氧化物酶。加入1∶200稀释的Cortactin抗体，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，滴加1～2滴二抗，37℃孵育15 min，DAB显色液显色10 min，显微镜下观察图像。染色强度判定参考以下标准：0分为无染色，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳性；阳性细胞比例判定参考以下标准：1分(0%～)，2分(25%～)，3分(50%～)，4分(75%～)。每张切片随机选择5个400倍视野，由2位病理科医师采用双盲法进行评价，若判定结果不一致，则由第3位医师做出最后判定。免疫染色评分(IRS)以染色强度和阳性细胞比例综合评定，两者相乘，IRS评分0～12分，其中0～3分代表阴性或低表达，>3分为高表达。

1.5 siRNA转染A549细胞

取3代以上生长状态良好的A549细胞，以1×105个/孔接种于6孔板中，37℃、5%CO2孵育24 h后进行转染。按照转染种类的不同分为3组：RNA干扰组(Cortactin-siRNA)、阴性对照组(Cortactin-NC)和空白对照组(Cortactin-BC)。Cortactin-siRNA组向每孔中加入5 μL Lipofectamine 2000、5 μL RNA干扰序列和500 μL不含血清的培养液，Cortactin-NC每孔中加入5 μL Lipofectamine 2000、5 μL RNA阴性对照序列和500 μL不含血清的培养液，Cortactin-BC组仅加入5 μL Lipofectamine 2000和500 μL不含血清的培养液。3组细胞均于37℃、5%CO2条件下孵育，待转染48 h后采用RT-PCR检测各组细胞Cortactin mRNA表达，从Cortactin-siRNA组、Cortactin-NC组、Cortactin-BC组中筛选出转染效率最高的细胞株，扩大培养，用于后续实验。

1.6 实时荧光定量PCR检测细胞Cortactin mRNA表达

收集生长状态良好的细胞，加入1 mL Trizol裂解液，冰浴上静置10 min。紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处吸光度值，A260/A280>2.0表示RNA纯度合格。取2 μL总RNA进行逆转录：2 μL总RNA中加入8 μL无核酸酶水和2 μL RT Primer，85℃反应5 min后置于冰浴3 min。再向上述12 μL混合物中加入RT缓冲液3 μL、dNTP 0.5 μL、RNase 1 μL、ddH2O 8 μL，反应条件：37℃ 60 min，85℃ 5 min。取5 μL逆转录产物作为模板，利用SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒进行RT-PCR，GAPDH作为内参，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃延伸40 s，35个循环后74℃延伸5 min。引物委托上海博尚生物技术有限公司设计合成，Cortactin，上游引物：5′-TGGGGAGGGGAATATACACA-3′，下游引物：5′-CTCTAGAGGAAGCCCCTCGT-3′；GAPDH，上游引物：5′-ATGTCGTGGAGTCTACTGGC-3′，下游引物：5′-TG-ACCTTGCCCACAGCCTTG-3′。目的基因表达量用2-ΔΔCt表示，每个样本均检测3次。

1.7 免疫印迹法(Western blotting)检测细胞Cortactin蛋白表达

取对数生长期细胞，弃去培养液，PBS冲洗，加入离心管中，再加入1 mL RIPA裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃条件下离心15 min，BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白纯度。将20 μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE电泳分离，常规湿法转膜，加入5%脱脂牛奶孵育封闭2 h。加入1∶200 Cortactin抗体，4℃孵育24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS冲洗3次，按照ECL化学发光显影试剂盒显影，以GAPDH作为内参照，分析目的条带相对表达量。

1.8 划痕实验检测细胞迁移能力

将细胞接种于6孔板，待细胞融合度≥70%时进行划痕实验。用Marker笔在培养板后均匀划间距为0.5 cm的横线(确保每孔至少有4条线穿过)，每孔中铺1×105个细胞，细胞融合度≥80%时用无菌移液枪枪头在单层细胞沿底部划出“一”字划痕，PBS冲洗3次后，分别于培养0、12、24、36 h在显微镜下测量划痕的宽度，并计算细胞迁移率。细胞迁移率=(初始划痕宽度-不同时间点划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。实验重复3次，取平均值。

1.9 Transwell实验检测细胞侵袭能力

用不含血清的DMEM培养液将转染后细胞浓度调整为1.0×105个/mL，Transwell上室每孔接种150 μL细胞，下室加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培养液作为趋化剂，37℃培养48 h，轻轻拭去表面非侵袭性细胞，4%多聚甲醛固定，苏木精染色10 min，200倍显微镜下统计穿透滤膜的细胞数。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 肺癌组织和癌旁组织Cortactin表达

Cortactin蛋白在肺癌细胞胞质呈蓝色，强阳性表达，在癌旁组织细胞质呈淡蓝色，弱阳性表达(图1A)。50例肺癌组织Cortactin高表达率为72.0%(36/50)，癌旁组织高表达率为24.0%(12/50)，肺癌组织Cortactin高表达率明显高于癌旁组织，两组间比较差异具有统计学意义(χ2=23.077，P<0.01)。

2.2 Cortactin表达与肺癌患者临床资料的关系

Cortactin表达与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移明显相关，肿瘤最大径≥3 cm组Cortactin高表达率明显高于肿瘤最大径<3 cm组，中高分化组Cortactin高表达率明显高于低分化组，有淋巴结转移组Cortactin高表达率明显高于无淋巴结转移组，各组间比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)；Cortactin表达与性别、年龄、TNM分期、组织学类型无关(均P>0.05)，见表1。

表1 Cortactin表达与肺癌患者临床资料的关系Table 1 Relationship between cortactin expression and clinicopathological data

2.3 Cortactin表达与肺癌患者生存预后的关系

50例肺癌患者共有44例获得完整随访资料，其中低表达组随访12例，高表达组随访32例，低表达组5年总生存率为42.1%，高表达组5年总生存率为13.7%，高表达组5年总生存率明显低于低表达组(P=0.018)，见图1B。

A：免疫组化染色检测肺癌组织和癌旁组织Cortactin表达情况;B：不同Cortactin表达水平肺癌患者生存曲线图1 Cortactin表达与肺癌患者生存预后的关系Fig.1 Correlation of cortactin expression with prognosis of patients with lung cancer

2.4 肺癌预后的影响因素

单因素和多因素分析显示，肿瘤直径大、淋巴结转移、高Cortactin表达是影响患者总生存率的独立危险因素(均P<0.05)，见表2。

表2 单因素和多因素分析影响肺癌预后的影响因素Table 2 Univariate and multivariate analysis of risk factors for prognosis of lung cancer patients

2.5 细胞转染效率评价

RT-PCR及Western blotting结果显示，Cortactin-siRNA组Cortactin表达水平明显低于Cortactin-NC组、Cortactin-BC组，差异具有统计学意义(均P<0.05)，Cortactin-NC组与Cortactin-BC组Cortactin表达差异无统计学意义(P>0.05)，证实siRNA抑制Cortactin表达的A549细胞模型构建成功，见图2。

2.6 抑制Cortactin表达对A549细胞迁移、侵袭的影响

划痕实验显示Cortactin-siRNA组细胞迁移率明显小于Cortactin-NC组、Cortactin-BC组，差异具有统计学意义(均P<0.05)，Cortactin-NC组与Cortactin-BC组细胞迁移率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3A。Transwell实验显示Cortactin-siRNA组穿膜细胞数明显少于Cortactin-NC组、Cortactin-BC组，差异具有统计学意义(均P<0.05)，Cortactin-NC组与Cortactin-BC组穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3B。

A：RT-PCR检测细胞Cortactin mRNA表达；B～C：Western blotting检测细胞Cortactin蛋白表达；①Cortactin-BC组；②Cortactin-NC组；③Cortactin-siRNA组；与Cortactin-siRNA组比较，*P<0.05图2 各组细胞Cortactin表达水平Fig.2 The expression of cortactin in cell lines

A：划痕实验检测细胞迁移能力；B：Transwell实验检测细胞侵袭能力；与Cortactin-siRNA组比较，*P<0.05图3 各组细胞迁移、侵袭能力比较(苏木精-伊红染色,×100)Fig.3 The migration and invasion capabilities in cell lines(HE staining,×100)

3 讨论

肿瘤细胞转移是一个多阶段、多步骤和多基因参与的复杂生物学过程[10-11]，包括黏附分子缺失、细胞迁移和侵袭能力增强、肿瘤细胞进入血液循环转移至其他组织并克隆生长新的肿瘤等。近20年来，尽管肺癌的早期诊断、放化疗及其他抗肿瘤治疗技术得到了显著发展，但转移、复发仍是导致肺癌高死亡率的主要原因[12-13]。肿瘤的侵袭、迁移功能与细胞外基质降解有关，并藉此穿透组织的屏障而转移至其他组织或器官。从亚细胞水平看，肿瘤细胞迁移运动的主要动力来源：侵袭性伪足的产生和细胞外基质的降解活性[14]。Cortactin是侵袭性伪足的主要功能蛋白，Cortactin通过分泌金属蛋白激酶参与降解局部基质蛋白[15]。Hirooka等[16]报道称肺癌的侵袭可能与细胞前端片状伪足的形成有关。然而Cortactin的表达是否参与侵袭、迁移过程以及Cortactin在此过程中发挥的作用尚不清楚。

本研究显示，肺癌组织Cortactin高表达率明显高于癌旁组织，提示Cortactin可能与肺癌的发生和进展有关。进一步分析显示Cortactin表达与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移明显相关，说明Cortactin在肺癌发生和转移过程中被诱导表达。王垒垒等[17]报道称Cortactin在胶质瘤细胞中表达上调，且与患者不良预后密切相关。Zhao等[18]在研究中发现原发性肝癌组织Cortactin表达增加，Cortactin高表达是原发性肝癌获得侵袭力的主要因素之一。本研究对肺癌患者进行随访，结果发现Cortactin高表达组5年总生存率明显低于低表达组，Cortactin高表达是影响患者总生存率的独立危险因素，说明Cortactin亦可以作为肺癌早期诊断和预后评估有价值的指标。陈翔等[19]报道称Cortactin表达与结肠癌TNM分期、淋巴结转移有关，Cortactin高表达结肠癌患者5年生存率为22.1%，低表达组为47.3%，Cortactin表达可能是促进结肠癌进展的因素之一。Hsu等[20]采用Cox多因素分析食管鳞癌的危险因素，结果显示浸润深度、TNM分期、淋巴管浸润、Cortactin均是影响食管鳞癌预后的独立影响因素。以上研究印证了Cortactin在肺癌中可能起到类似致癌因子的作用，并在肺癌细胞迁移、侵袭的过程中发挥重要作用。

肺癌细胞多呈侵袭性生长，以微卫星灶浸润肺组织，这亦是肺癌转移和复发的主要原因。Spillane等[21]研究证实Cortactin通过调节N-WASP、Arp2/3核复合体，诱导形成细胞膜指状突起结构，并水解局部蛋白，从而促进细胞向远处转移和侵袭。Ilatovskaia等[22]报道指出Cortactin能够调节Arp2/3发生结构变化，使细胞形成更加稳定的侵袭性伪足并促进细胞迁移、侵袭运动。在肿瘤细胞的迁移运动中，Cortactin通过诱导伪足形成大量分枝状肌动蛋白丝，这亦被认为是细胞运动的主要器官[23]。为了在细胞水平验证Cortactin对肺癌的迁移、侵袭作用，本研究采用siRNA技术抑制肺癌A549细胞Cortactin表达，并与阴性对照组和空白对照组进行比较，结果显示Cortactin-siRNA组细胞迁移率和穿膜细胞数明显少于Cortactin-NC组、Cortactin-BC组，说明抑制Cortactin表达能够降低肺癌细胞的侵袭、迁移能力。本研究由于实验室条件的限制，尚无法对Cortactin诱导侵袭性伪足的形态学变化进行观察，接下来我们也将联系有条件的单位共同研究Cortactin对伪足形态的变化及定位。此外，本研究的样本量偏少，仅为50例(尚有6例失访)，这也可能导致研究的结果存在偏差，接下来我们将继续收集肺癌样本量，以大样本量验证本研究的结果。

综上所述，肺癌组织Cortactin呈高表达，Cortactin表达与肺癌患者生存预后有关，抑制Cortactin表达能够降低肺癌细胞的侵袭、迁移能力，Cortactin有望成为肺癌治疗的新靶点。

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(2016-12-28 收稿)

Expression of Cortactin in Lung Cancer Tissue and Its Effects on Invasion and Migration

Long Qian，Luo Meng，Liu Dietal

Department of Thoracic Surgery，The People’s Hospital of Guizhou Province，Guizhou 550002，China

Objective To explore the expression of cortactin in lung cancer tissues and its effects on invasion and migration.Methods Non-small cell lung cancer tissue samples were colleted from 50 patients in the People’s Hospital of Guizhou Province.The expression of cortactin in tissues was mearsured by immunohistochemical staining.The relationship between cortactin expression and clinicopathological data was analysed.The patients with lung cancer were followed up postoperatively，and 5-year survival was recorded.For 5-year survival as evaluation index，the prognostic factors were evaluated by univariate and multivariate Cox proportional hazards model.The expression of cortactin in lung cancer cell line A549 was inhibited by siRNA，the cell migration capability was mearsured by wound-healing assay，and the cell invasion capality was mearsured by transwelll assay.Results The expression rate of cortactin in cancer tissue was 72%(36/50)，and 24%(12/50)in paracancerous tissue，the expression rate of cortactin in cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous tissues(P<0.01).The expression rate of cortactin in tumor was significantly higher in diameter ≥3 cm than that in tumor with diameter <3 cm，significantly higher in middle and high differentiated group than in poor differentiated group，significantly higher in lymph node metastasis group than in metastasis-free group(allP<0.05).Cortactin expression was not correlated with sex，age，TNM stage and histological type(P>0.05).The 5-year survival rate was 42.1% in low expression group，and 13.7% in high expression group；the 5-year survival rate of high expression group was significantly lower than that of low expression group(P=0.018).Cox multivariate analysis showed that tumor size，lymph node metastasis and high cortactin expression were independent risk factors for overall survival(allP<0.05).The result of wound-healing assay showed that migration cell number of cortactin-siRNA group was significantly less than that of cortactin-NC group and cortactin-BC group.Transwell assay showed that the number of transmembrane cells in cortactin-siRNA group was significantly less than that in cortactin-NC group and cortactin-BC group(allP<0.05).Conclusion The expression of cortactin is related to the prognosis of patients with lung cancer，inhibition of the expression of cortactin can reduce the invasion and migration capability of lung cancer cells，and cortactin is expected to be a new target for the treatment of lung cancer.

cortactin； lung cancer； survival rate； invasion； migration

*贵州省2016年科技联合基金项目[No.黔科合作LH(2016)7182]

R734.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.009

龙 谦，女，1987年生，副主任医师，E-mail：27314628@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：xuchuan627@sina.com