鼠尾草酸联合他莫昔芬通过激活Caspase-3信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡

贺文煜， 袁昌劲

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院中西医结合肿瘤科，武汉 430014

鼠尾草酸联合他莫昔芬通过激活Caspase-3信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡

贺文煜， 袁昌劲△

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院中西医结合肿瘤科，武汉 430014

目的 探讨鼠尾草酸联合他莫昔芬对乳腺癌细胞的影响及作用机制。方法 将乳腺癌细胞株MCF-7、T47D分为4组，对照组加入PBS，CA组加入鼠尾草酸，TAM组加入他莫昔芬，CA+TAM组加入鼠尾草酸和他莫昔芬。MTT增殖实验检测细胞增殖能力，集落形成实验检测细胞集落形成能力，Transwell小室实验检测细胞侵袭能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，免疫印迹法检测各组细胞Caspase-8、Caspase-3、PARP蛋白表达。结果 在0～20 μmol/L药物浓度时，CA、TAM、CA+TAM呈剂量依赖性抑制乳腺癌细胞增殖，但药物浓度为20 μmol/L与50 μmol/L对细胞增殖影响差异无统计学意义(均P>0.05)。CA+TAM组增殖抑制率明显高于CA组和TAM组(均P<0.05)。MCF-7和T47D细胞中，CA组、TAM组、CA+TAM组集落形成率、侵袭细胞数、细胞迁移率显著低于对照组(均P<0.05)；CA+TAM组集落形成率、侵袭细胞数、细胞迁移率显著低于CA组和TAM组(均P<0.05)，CA组和TAM组集落形成率、侵袭细胞数、细胞迁移率比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。在2种乳腺癌细胞株中，对照组、CA组、TAM组、CA+TAM组cleaved Caspase-8蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05)，CA组、TAM组、CA+TAM组cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达显著高于对照组(均P<0.05)，CA+TAM组cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达显著高于CA组和TAM组(均P<0.05)，CA组和TAM组cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05)。结论 鼠尾草酸联合他莫昔芬能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与激活Caspase-3/PARP信号通路有关。

鼠尾草酸； 乳腺癌； 他莫昔芬； 侵袭； 迁移； 增殖； 信号通路

乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤首位[1]，尽管近20年来乳腺癌的诊疗技术得到了极大的提高，但其远期生存率依然不容乐观，其中放化疗抵抗是导致乳腺癌治疗失败的主要原因[2]。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)是乳腺癌内分泌治疗常用的药物之一，对雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)均阳性者有效率为60%～70%[3-4]。然而并非所有乳腺癌患者均能从TAM治疗中获益，特别是部分复发患者，乳腺癌细胞可能对TAM耐药，导致治疗失败[5]。鼠尾草酸(carnosic acid，CA)是从唇形科植物迷迭香中提取的一种多酚类双萜化合物，目前已证实CA具有广泛的生物学活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等。有报道显示[6]鼠尾草酸能抑制K562/AO2细胞膜上P糖蛋白的表达，有效逆转人白血病细胞的多药耐药。然而关于CA对实体瘤的作用机制依然不清楚。本研究拟通过联合CA、TAM处理乳腺癌细胞株，观察其对细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响及可能的作用机制，旨在为乳腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞来源和培养

乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和正常人乳腺细胞MCF-10A购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，细胞接种于RPMI 1640培养液中(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)，将培养液置于恒温培养箱中，在37℃、5% CO2条件下培养。细胞保持贴壁生长，每隔2～3 d进行1次传代。

1.2 实验材料

RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司，鼠尾草酸、他莫昔芬(纯度>98%)均购自杭州大洋化工股份有限公司，RIPA裂解液、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自广州碧云天生物技术研究所。BCA蛋白检测试剂盒购自美国Thermo公司，Transwell小室、Matrigel人工基底膜购自美国BD公司，鼠抗人Caspase-8抗体、鼠抗人cleaved Caspase-8抗体、鼠抗人Caspase-3抗体、鼠抗人cleaved Caspase-3抗体、鼠抗人PARP抗体、鼠抗人cleaved PARP抗体、鼠抗人GAPDH抗体购自Santa Cruz公司，ECL显色试剂盒购自美国Pierce Biotechnology公司，聚烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸钠购自美国Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分组及处理 实验前，将CA和TAM分别用DMSO稀释成浓度为1、5、10、20、50 μmol/L，对照组加入等量PBS。按1×105/mL浓度将MCF-7、T47D、MCF-10A接种于6孔板中，1组加入等量DMSO作为对照，2组加入1 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，3组加入5 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，4组加入10 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，5组加入20 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，6组加入50 μmol/L CA或TAM或CA+TAM。将培养板置于37℃、5%CO2湿度恒温培养箱中继续培养24 h。

1.3.2 MTT增殖实验检测细胞增殖能力 取对数生长期细胞，用不含胎牛血清的培养液调整浓度为1×105/mL，接种于96孔板，每组设3个复孔，37℃、5%CO2湿度下培养。检测前4 h，向每孔中加入MTT试剂(20 μL/孔)继续孵育24 h，终止培养，1 000 g离心15 min，弃去上清液，每孔中加入150 μL DMSO溶解结晶物，室温下振荡15 min，置于酶标仪上检测570 nm处吸光度(A)值，以评价细胞生长能力。

1.3.3 集落形成实验检测细胞集落形成能力 药物处理的细胞继续培养7 d，将克隆细胞用PBS冲洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，Gimsa染色30 min，流水轻轻洗去染液，空气干燥后镜检。集落形成效率=克隆细胞数/接种细胞数×100%。

1.3.4 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 用不含血清的培养液将转染后细胞浓度调整为1.0×105个/mL，Transwell上室每孔接种150 μL细胞，下室加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培养液作为趋化剂，37℃培养48 h，多聚甲醛固定，苏木精复染10 min，200倍荧光显微镜下观察穿透滤膜的细胞数。

1.3.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 将细胞接种于6孔板，待细胞融合度≥70%时进行划痕实验。用Marker笔在培养板后均匀划间距为0.5 cm的横线(确保每孔至少有4条线穿过)，每孔中铺1×105个细胞，细胞融合度≥80%时用无菌移液枪枪头在单层细胞沿底部划出“一”字划痕，PBS冲洗3次，培养48 h后显微镜下测量划痕的宽度，并计算细胞迁移率。

1.3.6 免疫印迹法(Western blot)检测细胞Caspase-8、Caspase-3、PARP蛋白表达 取对数生长期细胞，弃去培养液，PBS冲洗，加入离心管中，再加入1 mL细胞裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃条件下离心15 min，BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白纯度。将20 μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE电泳分离，常规湿法转膜，加入5%脱脂牛奶封闭孵育2 h。加入相应的抗体(1∶1 000)鼠抗人Caspase-8抗体、Caspase-3抗体、PARP抗体、GAPDH抗体，4℃孵育24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS冲洗3次，按照ECL化学发光显影试剂盒显影，以GAPDH作为内参照，分析目的条带相对表达量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 CA联合TAM对乳腺癌细胞增殖的影响

在药物浓度为0～20 μmol/L时，CA、TAM、CA+TAM呈剂量依赖性抑制乳腺癌细胞增殖(图1A、1B)，CA、TAM、CA+TAM处理后对正常乳腺细胞MCF-10A增殖率无明显影响(均P>0.05，图1C)。与空白组比较，当药物浓度达到10、20、50 μmol/L时能明显抑制乳腺癌MCF-7、T47D细胞的增殖(均P<0.05)，其中10、20、50 μmol/L时CA+TAM组增殖抑制率明显高于CA组和TAM组(均P<0.05)。进一步分析显示，20 μmol/L和50 μmol/L的药物浓度对MCF-7、T47D细胞增殖率的影响差异无统计学意义(均P>0.05)，因此本研究选择浓度为20 μmol/L的CA和20 μmol/L的TAM进行后续试验。

A：对MCF-7细胞增殖的影响；B：对T47D细胞增殖的影响；C：对MCF-10A细胞增殖的影响；与CA组比较，#P<0.05；与TAM组比较，*P<0.05图1 不同浓度CA、TAM对细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentration of CA and TAM on cell proliferation

2.2 CA联合TAM对乳腺癌细胞集落形成的影响

在MCF-7和T47D细胞中，CA组、TAM组、CA+TAM组集落形成率显著低于对照组(均P<0.05)；CA+TAM组集落形成率显著低于CA组和TAM组(均P<0.05)，CA组和TAM组集落形成率比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见图2。

A：CA联合TAM对MCF-7细胞集落形成的影响；B：CA联合TAM对T47D细胞集落形成的影响；与Control组比较，▲P<0.05；与CA组比较，#P<0.05；与TAM组比较，*P<0.05图2 CA联合TAM对乳腺癌细胞集落形成的影响(Gimsa染色)Fig.2 Effects of CA combined with TAM on breast cell colony formation(Gimsa staining)

2.3 CA联合TAM对乳腺癌细胞侵袭的影响

在MCF-7和T47D细胞中，CA组、TAM组、CA+TAM组侵袭细胞数显著低于对照组(均P<0.05)；CA+TAM组侵袭细胞数显著低于CA组和TAM组(均P<0.05)，CA组和TAM组侵袭细胞数比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见图3。

2.4 CA联合TAM对乳腺癌细胞迁移的影响

在MCF-7和T47D细胞中，CA组、TAM组、CA+TAM组细胞迁移率显著低于对照组(均P<0.05)；CA+TAM组细胞迁移率显著低于CA组和TAM组(均P<0.05)，CA组和TAM组细胞迁移率比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见图4。

A：CA联合TAM对MCF-7细胞侵袭能力的影响；B：CA联合TAM对T47D细胞侵袭能力的影响；与Control组比较，▲P<0.05；与CA组比较，#P<0.05；与TAM组比较，*P<0.05。图3 CA联合TAM对乳腺癌侵袭能力的影响(苏木精-伊红染色,×100)Fig.3 Effects of CA combined with TAM on breast cell invasion capacity (HE staining,×100)

A：CA联合TAM对MCF-7细胞迁移能力的影响；B：CA联合TAM对T47D细胞迁移能力的影响；与Control组比较，▲P<0.05；与CA组比较，#P<0.05；与TAM组比较，*P<0.05图4 CA联合TAM对乳腺癌细胞迁移能力的影响(×100)Fig.4 Effects of CA combined with TAM on breast cell migration capacity (×100)

2.5 CA联合TAM对Caspase-3信号通路的影响

Western blot检测结果显示，MCF-7和T47D细胞中，对照组、CA组、TAM组、CA+TAM组cleaved Caspase-8蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05)；CA组、TAM组、CA+TAM组cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达显著高于对照组(均P<0.05)；CA+TAM组cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达显著高于CA组和TAM组(均P<0.05)，CA组和TAM组cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见图5。

A：MCF-7细胞凋亡蛋白表达水平；B：T47D细胞凋亡蛋白表达水平；与Control组比较，▲P<0.05；与CA组比较，#P<0.05；与TAM组比较，*P<0.05 图5 各组细胞凋亡蛋白表达水平Fig.5 Expression of apoptosis-related protein in earch group

3 讨论

TAM是治疗乳腺癌的常用药物，然而并非所有乳腺癌患者均能从TAM治疗中受益，特别是TAM首次治疗后复发的患者，由于TAM耐药导致后期治疗失败。在过去的几十年里，大量从自然界中提取的有效单体，如生物碱、多酚类、黄酮类等化合物在抗肿瘤治疗中起到重要的作用。鼠尾草酸是从唇形科迷迭香中提取的一类多酚类化合物，研究证实鼠尾草酸除了具有抗氧化作用，还具有抗炎、抗菌、抗病毒等活性[7-8]。陶萍华等[9]报道称鼠尾草酸能够保护氧自由基损伤的肝细胞，其作用机制与激活PI3K/Akt-Nrf2通路有关。

鼠尾草酸能够通过诱导抑癌基因表达、促进癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖等方式发挥抗癌作用[10]。Kar等[11]报道称鼠尾草酸以剂量和时间依赖性的方式抑制前列腺癌细胞的增殖，其作用机制与调节Akt/IKK/NF-κB通路激活磷酸酶2A有关。Roche等[12]则证实鼠尾草酸的结构与β-连环蛋白酶抑制剂相似，在体内发挥抗结直肠癌增殖作用。除了自身抗肿瘤活性外，鼠尾草酸亦有协同抗癌活性。李颢等[13]报道显示鼠尾草酸与姜黄素、三氧化二砷等联合使用，能够诱导Bax、Caspase-3等基因表达，进而促进急性髓性白血病细胞的分化。本研究采用鼠尾草酸联合他莫昔芬处理乳腺癌细胞，结果显示CA、TAM、CA+TAM呈剂量依赖性抑制乳腺癌细胞增殖，且CA+TAM组增殖抑制率明显高于CA组和TAM组，提示鼠尾草酸联合他莫昔芬能够抗乳腺癌细胞增殖。但是正常乳腺细胞MCF-10A增殖率无明显变化，提示CA+TAM对正常乳腺细胞增殖影响小，具有较高的安全性，这亦为乳腺癌治疗提供了一个新的思路。鼠尾草酸还具有逆转耐药的作用，Bobilev等[14]用20 μmol/L鼠尾草酸处理阿霉素耐药的白血病细胞株AO2，结果显示AO2细胞耐药基因mdr1、p-gp明显下调，使药物外排减少，从而发挥逆转耐药的作用。由于本研究未选择TAM耐药乳腺癌细胞株进行研究，因此尚无法判断鼠尾草酸是通过协同抗癌还是抑制细胞耐药发挥乳腺癌细胞增殖抑制的作用。

本研究进一步分析了鼠尾草酸联合他莫昔芬对乳腺癌细胞株水平运动能力的影响，结果显示CA+TAM组集落形成率、侵袭细胞数、细胞迁移率均显著低于CA组和TAM组，说明鼠尾草酸联合他莫昔芬具有抑制乳腺癌细胞运动和侵袭的作用，这也为乳腺癌远处转移和增殖提供了潜在的治疗策略。研究表明鼠尾草酸能够通过多种作用机制抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。Tai[15]等研究发现，鼠尾草酸能够阻断卵巢癌细胞的分裂周期，促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。曲辉等[16]报道显示鼠尾草酸通过抑制基底膜基质蛋白的表达，发挥抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的作用。Einbond等[17]采用不同剂量鼠尾草酸处理乳腺癌细胞株，结果发现低剂量时鼠尾草酸能够抑制细胞中谷胱甘肽的表达，高剂量时不仅能够诱导促凋亡蛋白的表达，还能抑制细胞周期调节基因和转录抑制因子的表达，抑制雌激素受体阴性的乳腺癌细胞的生长。

虽然部分研究发现了鼠尾草酸的抗肿瘤活性，但是关于其作用机制依然报道较少。研究证实绝大多数肿瘤细胞的凋亡最后均通过Caspase通路完成[18-19]，包括Cyto C介导线粒体凋亡途径和TNF-α介导的死亡受体凋亡通路。Caspase属于白介素-1转化酶家族，Caspase-8、Caspase-3是位于凋亡通路上的2个关键基因。Caspase-8对来自细胞外的凋亡诱导因子的刺激作出应答，以启动细胞解体。Caspase-3则通过激活下游靶基因PARP，促进细胞全面自杀性解体。Kamal等[20]报道称Caspase-3/PARP和Caspase-8信号通路均参与了药物性诱导的乳腺癌细胞凋亡，并上调下游Bax、Bad、Bcl-2等凋亡基因表达，抑制乳腺癌细胞的增殖。为了进一步证实鼠尾草酸联合他莫昔芬抑制乳腺癌细胞可能的作用机制，本研究采用免疫印迹法检测MCF-7和T47D细胞cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达，结果显示4组细胞cleaved Caspase-8蛋白表达差异无统计学意义，CA+TAM组cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表达显著高于CA组和TAM组，提示鼠尾草酸联合他莫昔芬可能是通过激活Caspase-3/PARP信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭。

综上所述，鼠尾草酸联合他莫昔芬能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，且对正常乳腺细胞无明显毒性作用，其作用机制可能与激活Caspase-3/PARP信号通路有关。但是本研究仅进行了体外细胞研究，其动物体内的安全性和有效性有待进一步证实。

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(2017-03-29 收稿)

Carnosic Acid Cooperates with Tamoxifen to Induce Apoptosis of Breast Cancer Cells through Caspase-3 Signaling Pathway

He Wenyu，Yuan Changjing△

Department of Oncology,Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，The Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430014，China

Objective To explore the effect of carnosic acid combined with tamoxifen on breast cancer cells and the mechanism.Methods Breast cancer cell lines MCF-7，T47D were divided into 4 groups：PBS was given to control group，carnosic acid(CA)was added to CA group，tamoxifen(TAM)was added to TAM group，and CA+TAM group was treated with carnosic acid and tamoxifen.The proliferation ability was measured by MTT assay，the colony formation capacity was measured by colony formation assay，the invasion ability was measured by Transwell chamber assay，the migration ability was measured by wound-healing assay，the expression of Caspase-8，Caspase-3 and PARP protein were measured by Western blotting.Results CA，TAM and CA+TAM suppressed breast cancer cell proliferation with a dose-dependent manner.Compared with CA group and TAM group，the proliferation inhibitory rate of CA+TAM group was significantly increased(P<0.05).In MCF-7 and T47D cell lines，compared to control group，the rate of colony fromation，number of invasive cells and cell migration rate of CA，TAM，CA+TAM groups were significantly decreased(allP<0.05).These indexes mentioned above in CA+TAM group were significantly lower than those in CA group and TAM group(allP<0.05)，but there were no significant differences between CA group and TAM group (allP>0.05).In two breast cancer cell strains，the expression of cleaved Caspase-8 protein between control，CA，TAM and CA+TAM groups was not significantly different(P>0.05).Compared to control group，the expression levels of cleaved caspase-3，cleaved PARP protein in CA，TAM and CA+TAM groups were significantly increased(P<0.05)，and these protein levels were significantly higher in CA+TAM group than in CA and TAM group(allP<0.05).But there were no significant differences between CA group and TAM group(allP>0.05).Conclusion Carnosic acid combined with tamoxifen can suppress the proliferation，invasion and migration of breast cancer cells，and its mechanism may be related to the activation of Caspase-3/PARP signaling pathway.

carnosic acid； breast cancer； tamoxifen； invasion； migration； proliferation； signaling pahway

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.007

贺文煜，女，1986年生，住院医师，硕士研究生，E-mail:hewenyu86@163.com

△通讯作者，Correspongding author,E-mail:13607169125@139.com