超高效液相色谱串联飞行时间质谱法测定水产品中18种磺胺类化合物
2017-09-03易路遥虞雪军
熊 雯 易路遥 晏 亮 陆 庆 虞雪军 章 红
(江西省药品检验检测研究院,江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心, 南昌 330029)
超高效液相色谱串联飞行时间质谱法测定水产品中18种磺胺类化合物
熊 雯 易路遥 晏 亮 陆 庆 虞雪军 章 红*
(江西省药品检验检测研究院,江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心, 南昌 330029)
采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)结合QuEChERS净化处理,对淡水产品中18种磺胺类化合物进行准确的鉴定。Chromalynx XS软件将化合物的保留时间以及一级母离子精确质量数作为定性依据,筛查样品中阳性化合物,对疑似阳性化合物进行人工比对二级碎片离子信息,以进一步确证阳性化合物。本实验对草鱼、黄鳝、螃蟹3种淡水产品基质效应进行考察,基质匹配外标法定量,结果表明,在50~1000μg/kg浓度范围内,18种目标化合物线性关系良好,方法检出限为2~20μg/kg,对3种基质在200、400、800μg/kg 3个添加水平的18种磺胺类化合物进行测定,回收率在70.0~124.6% 之间。
超高效液相色谱串联飞行时间质谱 QuEChERS净化 磺胺类化合物
磺胺类药物(SAs)易造成人体泌尿系统损害、破坏人的造血系统,并具有致癌性及过敏性反应[1,2]。由于磺胺类药物具有抗菌谱广、高效、性质稳定、价格低廉等特点,水产养殖户长期大量使用磺胺类药物,造成水产品药物残留严重现象, 从而影响人类的健康并造成机体耐药性[3,4]我国农业部235号公告规定磺胺类药物在肌肉中的残留总量控制在100μg/kg内[5]。
目前磺胺类药物残留检测的前处理方法有液液萃取法[6,7]、加速溶剂萃取法[8]、固相萃取小柱法[9,10]和QuEChERS法[11,12]等,前3种方法在有机溶剂消耗大、设备复杂、成本高、操作繁杂等方面存在不足。而QuEChERS是一种快速、简单、廉价、高效、可靠、安全的前处理方法,其早已运用于农药残留检测的官方方法AOAC 2007.01和欧盟CEN 2002/657/EC,近年来,在兽药检测方面也得到了广泛运用。水产品中含大量蛋白质和脂肪,采用高效的前处理方法对于准确检测其中磺胺药物残留具有重要意义。
超高效液相色谱-电喷雾-串联四极杆质谱法是检测动物源性食品中药物残留的重要方法,由于受仪器扫描速度限制,检测通量有限且只适合已知目标物的检测。随着高分辨质谱技术的发展,飞行时间质谱法凭借高通量、高分辨率、谱库检索、不依靠标准品也可分析等能力开始在痕量分析领域得到应用[13]。
本研究中,采用QuEChERS方法进行前处理,结合液相色谱-高分辨飞行时间质谱法联用技术,建立了18种磺胺类药物的HPLC-QTOF-MS一级精确质量数据库与相应二级谱库。应用一级数据库对具有明显特征离子的磺胺兽药进行鉴定,对疑似磺胺化合物进行二级确证,该方法可以快速、准确对水产品中磺胺化合物筛查定性。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
超高效液相色谱-Q-TOF质谱仪(美国Waters),色谱柱C18(美国Waters);离心机(美国ThermoFisher);涡旋混合器(德国IKA)。
18种磺胺类标准品购自Sigma及Dr.Ehrenstorfer GmbH司,纯度均大于95%;乙腈、甲醇等有机试剂均为色谱纯(Sigma);NaCl为分析纯(国药集团);十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)(岛津公司)。
1.2 材料
草鱼、黄鳝、螃蟹(市售)。
1.3 标准溶液的制备
分别准确称取各种SAs的标准品25mg于50mL容量瓶中,加入少量乙腈溶解,用乙腈定容至刻度,配制浓度为 500 mg/L 的单标储备液,于-20℃条件下储存。分别移取0.8mL 各单标储备液于 50mL 容量瓶中,用初始流动相定容至刻度,配制浓度为8mg/L混合标准储备液,于 -20 ℃条件下储存。移取适量混合标准储备液于容量瓶中,用初始流动相定容至刻度,逐级稀释成 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2.0mg/L 的混合标准工作液,于 4℃ 条件下储存备用。
1.4 色谱-质谱条件
ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)色谱柱;柱温40℃;进样量:1μL;流动相:A相为5mmol乙酸铵溶液(含0.1%甲酸),B相为乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脱程序: 0~1.2min,98%A;1.2~5.0min,98~80%A;5.0~6.0min,80%A;6.0~8.0min,80~2%A;8.0~10.0min,2%A;10.0~11.0min,2~98%A;11.0~15.0min,98%A;流速:0.4mL/min。
离子源:ESI源;扫描方式:正离子扫描;扫描范围:m/z100~1000;毛细管电压:3000V;干燥气温度500℃,干燥气流速1000L/h;锥孔气流速 50L/h;锥孔电压40V;碰撞能 15~40V (MS/MS采集时);质谱采集时间:2.0~11.0min 。
1.5 样品前处理
称取5g经均浆后的样品,加入5mL 5%甲酸乙腈,振荡30s,加入4.0g NaCl,涡旋30s,8000r/min离心5min,取1mL上清液,待净化。将1mL上清液转移至2mL净化管中(含PSA 50mg、C18 50mg),涡旋30s,10000r/min 离心1min,取上清液,过0.22μm滤膜,上机分析。
1.6 数据库的建立
1.6.1 一级精确质量数据库
在优化的色谱-质谱条件下,对18种磺胺化合物进行一级质谱全扫描,获得目标物的保留时间、母离子,通过Chromalynx XS软件输入化合物名称、保留时间、分子式、精确相对分子质量、CAS号,建立了18种磺胺化合物的一级精确质量数据库。
1.6.2 二级碎片离子确证
将目标物精确质量母离子在碰撞能量15~40V下进行测定,采集目标物的子离子信息。
2 结果与讨论
2.1 样品提取溶剂的选择
SAs的提取溶剂一般采用乙腈、甲醇、乙酸乙酯及二氯甲烷[14],本实验选用乙腈作为提取溶剂,有以下几个原因:①乙腈对组织渗透力强,提取效果好,而乙酸乙酯、二氯甲烷渗透能力则较差;②磺胺属于极性偏弱的化合物,乙腈极性比甲醇弱,对大部分磺胺化合物乙腈提取效果较好;③乙腈能较好的沉淀水产品中的蛋白质,且相对于乙酸乙酯和二氯甲烷,用乙腈不会萃取出很多的油性物质,如蜡、脂肪和油性色素等。本试验考察了乙腈、含1%甲酸乙腈以及含5%甲酸乙腈的提取效率,结果发现,纯乙腈提取效果较差,而酸化乙腈具有比较好的提取效果,这可能是由于磺胺属于弱碱性化合物,更易溶于酸性溶剂的原因。对比含1%甲酸乙腈与含5%甲酸乙腈的提取效果,发现使用5%甲酸乙腈时化合物整体表现出更高的回收率,其各化合物回收率均达70%以上。因此,选用含5%甲酸乙腈作为提取溶剂。
2.2 QuEChERS净化条件的优化
PSA通过氢键和化合物作用,可去除脂肪酸、部分有机酸、糖和色素。C18吸附剂是在硅胶基质上接有十八烷基,对油脂、甾醇和维生素的去除效果显著。结合水产品基质特性以及磺胺类化合物的理化性质,本实验采用混合型净化剂,并对PSA和C18的用量进行优化,结果表明50mgPSA,50mgC18时目标化合物平均回收率最高,提取净化效果最好,本实验室采用该组合作为最佳QuEChERS净化剂。
2.3 色谱条件的选择和优化
实验考察了ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)与Agilent C18(4.6×50mm,1.7μm) 两种色谱柱。实验发现,使用ACQUITY UPLC BEH C18,所有化合物在7min内全部出峰,对同分异构体,也可达到比较好的分离效果;而对Agilent C18,液相时间达到25min时,同分异构体才能分开,且峰形较差。由于磺胺化合物多为碱性化合物,实验发现,在A、B流动相中均加入0.1%甲酸,可较好的提高化合物响应。18种磺胺类化合物的总离子流图如图1所示。
图1 18种磺胺类化合物的总离子流图
2.4 一级、二级质谱定性确证
通过对样品中18种磺胺化合物的一级母离子精确质量质谱分析,可能会出现假阳性结果,此时需对可疑化合物进行二级子离子信息确证,可进行人工比对二级碎片离子信息,以进一步确证阳性化合物。根据欧盟SANCO/12571/2013决议,当有两个及两个以上的特征离子匹配,则可确证其为目标物。欧盟规定,用高分辨质谱TOF进行确证时,至少需要两个确证离子,一个分子离子和至少一个碎片离子,且质量偏差在5×10-6之内。2002/657/EU中对高分辨质谱的目标化合物进行确证评分标准为,母离子2.0分,一个子离子2.5分,至少4.0分达到定性要求。18种磺胺化合物保留时间、质谱信息整理如表1所示。
表1 磺胺化合物保留时间、质谱信息表
续表1
2.5 基质效应评价
液相色谱-串联质谱中的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致,表现为离子增强或抑制作用[16]。实验考察草鱼、黄鳝、螃蟹的基质效应,在不同基质提取液和纯试剂中添加标样,对比目标化合物在基质液和纯试剂中的信号峰面积,得到基质响应相对强度。结果表明,在3种水产品基质中,18种磺胺的基质效应在88.5%~118.2%之间,基质效应不明显。
2.6 方法学验证
2.6.1 线性范围与检出限
选用不含18种待测组分的空白基质样品,经1.5节样品前处理,得空白基质溶液。分别精密吸取混合标准工作液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2mg/L )各500μL,加空白基质溶液500μL,配制成浓度为50、100、200、400、800、1000μg/L的(草鱼、黄鳝、螃蟹)基质标准溶液,绘制标准工作曲线。以峰面积y为纵坐标,浓度x为横坐标,各目标化合物在50~1000μg/kg范围内线性关系良好,相关系数(r) 为0.9942~0.9999。在基质空白样品中添加标准溶液,以信噪比 S/N≥3确定方法检出限(LOD),结果为2~20 μg/kg。以草鱼基质为代表,列出各化合物线性回归方程、相关系数及方法的检出限,见表2。
表2 草鱼基质各化合物线性回归方程、相关系数及方法的检出限
续表2
2.6.2 回收率
以空白样品做添加回收实验,在草鱼、黄鳝、螃蟹空白样品中分别添加不同量的混合标准溶液(添加水平分别为200、400和800μg/kg),每个浓度设置2个平行样,按上述优化的实验方法测定各种磺胺类药物的回收率。3种水产品中,18种磺胺样品的回收率均在70.0%~124.6%之间。其中,草鱼平均回收率为74.3%~107.8%之间;黄鳝样品的平均回收率在83.7%~103.0%之间;螃蟹样品的平均回收率在70.5%~96.6%之间。
3 结论
建立了针对3种水产品基质中18种磺胺类药物的LC-Q-TOF的筛查与确证方法,对提取试剂、净化吸附剂条件进行优化,并对基质效应及方法学进行评价,本实验方法将QuEChERS 前处理与高分辨质谱检测结合,实现草鱼、黄鳝、螃蟹中目标化合物的快速准确筛查分析,本方法快速、高效、准确度高。
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Xiong Wen, Yi Luyao, Yan Liang, Lu Qing, Yu Xuejun, Zhang Hong*
(Jiangxi Institute For Drug Control, Jiangxi Drug and Medical Devices Quality Engineering Center, Nanchang 330029, China)
The accurate mass and retention time were utilized to screen the positive compounds by Chromalynx XS. The suspected sulfonamides were evaluated using artificial comparison of MS2ions for the futher identifying.The matrix effects in three kinds of typical foods were investigated and the quantification was carried out by matrix-matched with external standard method.The results demonstrated that the linear ranges were from 50μg/kg to 1000μg/kg with good correlation coefficients. The method detection limits were in the range of 2μg/kg to 20μg/kg. The average recoveries at three spiked levels were in the range of 70.0%-124.6% for grass carp,ricefield eel and crab.
ultra performance liquid chromatography-Q-time of flight mass spectrometry(UPLC-MS/MS);QuEChERS sample preparation;sulfonamides
江西省科技计划项目[20142BBF60028];江西省食品药品监督管理局科技计划[2015SP04]
10.3969/j.issn.1001-232x.2017.04.009
2017-02-22
熊雯,女,1983年生,中级理化检验师,主要从事食品药品检验研究,E-mail:2163809168@qq.com。
章红,女,1968年生,主任药师。