骨碎补总黄酮对高原RA继发OP患者血清MMP-3、CD200及IL-17的作用研究

陈楷鸣，陈慧，王彩燕，刘军*

(1.兰州军区总医院手术麻醉科，甘肃 兰州 730050；2.兰州军区总医院全军骨科中心关节外科，甘肃 兰州 730050)

实验研究

骨碎补总黄酮对高原RA继发OP患者血清MMP-3、CD200及IL-17的作用研究

陈楷鸣1，陈慧2，王彩燕1，刘军2*

(1.兰州军区总医院手术麻醉科，甘肃 兰州 730050；2.兰州军区总医院全军骨科中心关节外科，甘肃 兰州 730050)

目的 研究骨碎补总黄酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)对高原类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)继发骨质疏松(osteoporosis，OP)患者血清基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、CD200、白介素-17(interleukin-17，IL-17)的影响。方法 选取我院2012年6月至2016年6月收治的38例高原RA继发OP患者为研究对象，选取38例单纯高原RA患者做为对照组，研究组给予骨碎补总黄酮胶囊(每粒含骨碎补总黄酮180 mg，2粒/次，3/日，8周)治疗，组内所有患者均于治疗前和治疗后同一天抽取静脉血，采用蛋白印迹法(Western blotting)检测MMP-3、CD200和IL-17表达变化，以探寻高原RA继发OP的分子机制，为临床治疗提供参考依据。结果 与正常对照组比较，骨碎补总黄酮组治疗前患者血清MMP-3、IL-17表达升高(P<0.05)，CD200表达降低(P<0.05)；经骨碎补总黄酮治疗后，骨碎补总黄酮组患者血清MMP-3、IL-17表达降低(P<0.05)，CD200表达升高(P<0.05)。结论 在高原RA继发OP患者发病中MMP-3、CD200及IL-17可能起到重要作用，细胞因子直接或间接影响机体免疫功能和炎症反应，骨碎补总黄酮能有效抑制上述因子的不良作用。

骨碎补总黄酮；类风湿关节炎；骨质疏松；基质金属蛋白酶-3；CD200；白介素-17

目前研究发现，高原和低氧条件均影响和调节骨的生长代谢水平，有学者报道，高原低氧环境下，人体的骨折修复愈合困难，骨密度较平原下降，且易导致骨质疏松(osteoporosis，OP)等慢性骨损伤的发生[1]。在成骨和破骨作用的动态平衡中，高原低氧可促进破骨过程，抑制成骨作用。在低氧条件下培养成骨细胞发现，骨形态基因发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)表达在48 h降低35%，在96 h降低45%，此现象可能和骨生长中的关键因子β转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、BMP及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达均受到不同程度抑制相关[2]。单因素和logistic多元回归分析显示，高原地区的低氧分压、寒冷及高原人群负重活动时间相对较少，是导致骨质疏松发生率较高的危险因素。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种对人体多关节具有侵袭性的自身免疫性疾病。随着疾病的不断进展，由小关节病变、手指“天鹅颈”、“纽扣样”改变到累及心肺及神经系统受累，RA的发展和骨破坏、骨质疏松呈正相关。为探讨高原RA继发OP病因，我们对其与基质金属蛋白酶-3(metalloproteinase，MMP-3)、白细胞介素-17(interleukin，IL-17)及CD200的相关性加以研究，探寻各指标在疾患中的作用及骨碎补总黄酮对各指标的影响，以期提供临床治疗经验及理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究组 收集2012年6月至2016年6月期间在兰州军区总医院住院的类风湿关节炎继发骨质疏松患者38例，全部在海拔2000 m以上地区居住十年以上。入选标准：a)1987年美国风湿病学会的分类标准；b)2009年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟制订的新RA分类标准和评分系统；c)近三个月内未服用过任何免疫调节剂、激素等进行治疗；d)治疗前双能X线吸收测定法检测腰椎及髋关节骨密度为：T-Score<-2.5～-1.5，平均为T-Score<-2.0。排除标准：RA晚期需行人工关节置换患者、恶性肿瘤、严重感染性疾病、四肢肌力小于Ⅱ级、高血压极高危组患者。其中男12例，女26例，年龄41.5～66.5岁。研究组在抗RA治疗基础上给予骨碎补总黄酮胶囊(每粒含骨碎补总黄酮180 mg，2粒/次，3/日)，治疗持续时间为8周。本研究经医院伦理委员会批准，在告知所有研究参与人员或法定委托人本研究的目的及意义后，均同意并签署治疗知情同意书后方可进入本研究阶段。

1.1.2 对照组 选取38例高原RA患者，纳入标准第4条修正为：患者治疗前双能X线吸收测定法检测腰椎及髋关节骨密度为：T-Score>-1；排除标准同上。其中男10例，女28例，年龄42.0～65.0岁，同意并签署治疗知情同意书。对照组患者给予常规抗RA治疗。两组在性别、年龄、身高、体质量、病情等方面差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 骨碎补总黄酮组和对照组治疗前后均于同一天上午6时一次采集外周静脉血5 mL，置于肝素抗凝管中，按3 000 r/min低温离心10 min后取血清放置于-70℃冰箱贮存。

1.2.2 检测方法 Western blotting法测定血清中MMP-3、CD200及IL-17含量表达水平，取定量样品，SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭，洗膜，加入1︰600稀释的MMP-3、CD200及IL-17一抗，4℃下过夜存放，用洗膜液漂洗后加入1︰1 000稀释的二抗，摇床1 h，TBST(tris buffered saline tween)冲洗3遍，每次5 min，加电化学发光法(electric chemi lumine scence，ECL)荧光液显色，上机检测。用目标条带与内标条带(β-actin)的积分吸光度值(integrated absorbance，IA)比值的百分率表示MMP-3、CD200和IL-17的表达水平。

2 结 果

2.1 骨碎补总黄酮治疗前后，高原RA继发OP患者MMP-3表达水平比较 与对照组(0.65±0.05)相比，高原RA继发OP患者治疗前MMP-3为(1.26±0.08)，表达增高(P<0.05)；骨碎补总黄酮治疗后，患者MMP-3为(0.76±0.07)，表达降低(P<0.05)；且骨碎补总黄酮治疗前后之间比较，患者MMP-3表达降低(P<0.05)。见图1。

图1 骨碎补总黄酮治疗前后MMP-3蛋白表达水平变化

2.2 骨碎补总黄酮治疗前后，高原RA继发OP患者CD200表达水平比较 与对照组(0.95±0.07)相比，骨碎补总黄酮治疗前，高原RA继发OP患者CD200为(0.51±0.04)，表达降低(P<0.05)，骨碎补总黄酮治疗后，患者CD200为(0.83±0.06)，表达升高(P<0.05)，且骨碎补总黄酮治疗前后比较，患者CD200表达水平增高(P<0.05)。见图2。

图2 骨碎补总黄酮治疗前后CD200蛋白表达水平变化

2.3 骨碎补总黄酮治疗前后，高原RA继发OP患者IL-17表达水平比较 与对照组(0.71±0.05)相比，骨碎补总黄酮治疗前，高原RA继发OP患者IL-17为(1.50±0.09)，表达增高(P<0.05)，骨碎补总黄酮治疗后，患者IL-17为(1.08±0.08)，表达降低(P<0.05)，且骨碎补总黄酮治疗前后之间比较，患者IL-17表达水平降低(P<0.05)。见图3。

图3 骨碎补总黄酮治疗前后IL-17水平表达水平变化

3 讨 论

高原低氧环境下可使机体免疫应答能力升高，增加炎性因子的表达水平。Arnett及Knowles等[3-4]学者通过不同研究发现，低氧诱导因子1ɑ可通过血管生成素样蛋白-4间接激活破骨细胞的生成，高表达的破骨细胞进而发挥刺激骨吸收的作用。Utting和Knowles等[5-6]均证实低氧环境可促进线粒体内活性氧的产生，通过线粒体功能障碍，使巨核细胞分化为破骨细胞数量增加。郗焜及陈亮等[7-8]报道海拔较高环境下老年男性久居人群的血清骨代谢生化指标、脂肪细胞因子Chemerin等指标会相应发生不同程度的变化，低氧环境在其中发挥重要影响。杜珊珊等[9]报道降钙素可通过作用于CD36及IL-17等生物因子发挥抗高原骨质疏松的作用，其机制可能和调节机体免疫系统相关。李得春等[10]研究表明青海高原地区老年妇女OP患者骨密度水平显著性低于对照组，这一结果提示高原地区的缺氧环境可能诱发骨质疏松的发生，患者血清中低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1ɑ、HIF-2ɑ及VEGF和骨代谢过程存在密切联系。长期RA病史的患者往往伴随骨质疏松，表现为全身骨量明显减少，骨组织显微结构发生改变，例如骨小梁变细、骨皮质变薄、骨脆性明显增高等。RA进展至晚期时可导致软骨、骨(皮质骨/松质骨)、肌腱、韧带和血管等多个组织的破坏，通过影响骨代谢过程而导致骨密度降低。因而，较之一般RA患者，高原低氧环境下久居的RA患者常伴随严重的OP问题。骨碎补总黄酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)作为传统的提高碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen，Col Ⅰ)及骨钙素(bone gla protein，BGP)的中药，副作用小、经济、安全，在治疗OP领域具有极大潜力。

MMPs是一组降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要酶系，在炎症反应、自身免疫性疾病、恶性肿瘤浸润及心脑血管疾病等多个过程发挥作用，其中MMP-3属于基质金属蛋白酶中的明胶酶型。在动物模型中利用三点弯曲和压缩试验测定骨组织的模量和硬度发现，在明胶酶型基质金属蛋白酶高表达情况下，实验小鼠的骨质密度及强度均低于野生小鼠。有研究证实在妇女绝经后发生的OP过程中，血清骨保护素浓度和同属明胶酶型的MMP-2表达的增强可能是骨质疏松高转换状态的标志。本研究中发现，与对照组相比较，高原RA继发OP患者MMP-3表达增高(P<0.05)，经骨碎补总黄酮治疗后的患者MMP-3表达降低(P<0.05)。提示高原RA继发OP患者的MMP-3含量发生明显改变，可能和下列因素相关：a)MMP-3可逐渐降解覆盖于骨组织表面的Ⅰ型胶原屏障，诱使破骨细胞与矿化骨基质直接接触，启动骨吸收过程；b)MMP-3通过影响炎症因子、化学因子及非蛋白水解功能，影响骨代谢；c)TFRD具有抑制破骨细胞生成和调控成骨增殖能力。

CD200分子质量为41-47 kDa，是一种Ⅰ型膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。CD200及其受体蛋白CD200R参与多种自身免疫性疾病发生、发展过程，有研究显示系统性红斑狼疮(S患者CD4+T细胞、树突状细胞及血清游离CD200水平高于健康对照组[11]。RA患者经英夫利西单抗联合甲氨碟呤治疗后，随着血沉、C反应蛋白的降低，CD200/CD200R在患者外周血单核细胞及辅助性T细胞中呈现高表达，其作为抗炎信号通过多种机制发挥免疫抑制作用[12]。本研究发现CD200在高原RA继发OP患者经TFRD治疗后明显升高(P<0.05)，其机制可能为：a)CD200通过作用机体神经元-小神经胶质细胞或神经胶质细胞间的相互作用抑制免疫应答影响；b)CD200抑制免疫功能的途径可能和调控单核-巨噬细胞、Thl7细胞及破骨细胞的形成相关；c)TFRD通过调节下丘脑-垂体-性腺轴功能、改善机体免疫系统的紊乱状态，发挥保护功能。

白细胞介素-17(interleukin 17，IL-17)是一种强有力的促炎因子，也是炎症反应的微调因子，可以诱导多种促炎因子的产生，包括IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-ɑ(tumor necrosis factor-α，TNF-ɑ)及MMPs等[13]。对胶原诱导关节炎小鼠模型应用抗体中和内源性IL-17的研究发现，动物模型的关节炎性改变降低、软骨及骨的侵蚀破坏受到抑制。RA患者的滑膜液细胞(synovial fluid cell，SFMc)中由CD4+T淋巴细胞分泌的IL-17及TNF-ɑ的水平均较对照组升高。在本研究中，与对照组相比，骨碎补总黄酮治疗前，高原RA继发OP患者IL-17表达增高，骨碎补总黄酮治疗后，高原RA继发OP患者IL-17表达降低(P<0.05)，分析原因可能为：a)IL-17通过刺激滑膜细胞表达分泌角质细胞生长因子(keratinocyte grownl factor，KGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growtll factor，HGF)等血管因子促进血管翳的形成，通过诱导MMPs破坏蛋白多糖分子及促破骨细胞生成影响机体关节功能的骨密度[14]；b)TFRD通过影响炎症过程进而抑制骨密度下降，提高骨矿化能力。

综上所述，高原RA继发OP患者中，MMP-3、CD200及IL-17通过多种作用途径影响疾病转归过程，其表达水平变化具有重要意义。骨碎补总黄酮通过作用于上述因子，发挥抑制炎症反应、增强机体免疫功能，同时可防止骨质疏松程度加重。其具体作用分子信号通路需要我们进一步研究。

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Expression and Significance of MMP-3、CD200 and IL-17 in the Plateau RA with Osteoporosis Patients after Treatment with TFRD

Chen Kaiming1，Chen Hui2，Wang Caiyan1，et al

(1.Department of Surgical Anesthesia，Lanzhou General Hospital of PLA，Lanzhou 730050，China；2.Department of Orthopaedics Center，Lanzhou General Hospital of PLA，Lanzhou 730050，China)

Objective To study the diference of the Matrix metalloproteinase-3(MMP-3)，CD200 and Interleukin-17 levels of the patients with plateau RA with osteoporosis patients before and after treatment with TFRD.Methods Tests on 38 patients before and after treatment with TFRD in RA with osteoporosis patients，the control group by administering TFRD (1 080 mg/d；after 8 week)，all patients before treatment and after treatment for venous blood，using MMP-3，CD200 and IL-17 to detect the Western expression of blot.Results Compared with the control group，the MMP-3，IL-17 expression increased significantly and CD200 expression decreased in the former TFRD group of patients(P<0.05)；after treatmen with TFRD，the MMP-3，IL-17 were decreased(P<0.05)，the CD200 expression was increased significantly(P<0.05).Conclusion The MMP-3，CD200 and IL-17 may play an important role in the highlands of RA with OP patients，cytokines directly or indirectly affect immune function and inflammatory response，TFRD can effectively prevent osteoporosis patients degree of aggravation.

total flavonoids of rhizoma drynariae；rheumatoid arthritis；osteoporosis；matrix metalloproteinase-3；CD200；interleukin-17

1008-5572(2017)08-0711-04

甘肃省青年科技基金(1606RJYA300)；*本文通讯作者：刘军陈楷鸣，陈慧，王彩燕，等.骨碎补总黄酮对高原RA继发OP患者血清MMP-3、CD200及IL-17的作用研究[J].实用骨科杂志，2017，23(8)：711-714.

R593.21

A

2017-04-05

陈楷鸣(1982- )，女，护师，兰州军区总医院手术麻醉科，730050。