超声波辅助提取菠萝皮渣多糖及其抗氧化活性研究

王标诗,吴艺华,周泽捷,江 敏,胡小军,彭元怀,杨 娟,刘淑敏

(岭南师范学院化学化工学院,广东湛江 524048)

超声波辅助提取菠萝皮渣多糖及其抗氧化活性研究

王标诗,吴艺华,周泽捷,江 敏,胡小军,彭元怀,杨 娟,刘淑敏

(岭南师范学院化学化工学院,广东湛江 524048)

采用超声波技术辅助提取菠萝皮渣多糖,利用正交设计实验优化其提取工艺,并利用体外实验研究该多糖对羟自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力及其还原能力,以评价其抗氧化活性。研究结果表明,超声波辅助提取最佳工艺参数为:料液比1∶50 (m/v),时间40 min,温度60 ℃,功率为570 W,该条件下多糖的得率为2.38%;在本实验浓度范围(1.50～3.50 mg/mL)内,菠萝皮渣多糖对·OH的清除率随其浓度的增加而增加,但清除能力均低于同浓度VC,清除DPPH·自由基的IC50为2.47 mg/mL,对Fe3+的还原能力随多糖浓度的增加而增加。可见,超声波辅助提取工艺效果较好,能缩短提取时间,提高菠萝皮渣多糖的得率;体外抗氧化实验表明菠萝皮渣多糖具有一定的抗氧化活性。从菠萝皮渣中提取活性多糖,可以变废为宝,实现菠萝资源的高值化利用。

菠萝皮渣,多糖,超声提取,抗氧化

菠萝又名凤梨,是凤梨科凤梨属植物,原产美洲热带和亚热带,是多年生草本植物。是热带和亚热带地区的著名水果,我国是菠萝十大主产国之一,主要分布在广东、海南、广西、福建、云南等省[1]。菠萝果实营养丰富,含有还原糖、氨基酸、蛋白质、粗纤维和有机酸等。主要以菠萝为原料的综合开发新产品如菠萝蛋白酶、菠萝纤维、菠萝凉果、菠萝饲料、菠萝酒和菠萝生物有机肥等也将逐渐形成规模生产,进入国内外市场[2]。菠萝果实由于不易贮存,除极少部分用于直接销售鲜食外,大部分用于加工。菠萝在鲜食或加工利用时,被丢弃的外皮和果心等废料成为菠萝皮渣,其重量大约为全果的50%～60%[3]。若菠萝皮渣不加以综合利用,则可造成资源的浪费和环境的污染。

菠萝皮渣的高值化综合利用,不仅有利于解决环境问题,还将带来良好的经济效益。目前,对菠萝皮渣的综合开发利用研究主要集中在以下几个方面,一是生物发酵利用:如氢气、乙醇、沼气[3]和动物饲料[4]等;二是营养成分和功能成分的提取和利用:如酚类物质[5]、果胶[6-7]、色素[8]、膳食纤维等的提取与利用[9-11];三是食品轻化工领域的应用:果醋的加工[13]、有机酸的生产[14]、虾青素的生产[15]、金属吸附剂的制备和利用[16]等。李俶等[17]研究表明,菠萝皮渣总糖含量为93.6%。目前,多糖的提取技术有:溶剂(水、酸、碱、乙醇)提取法,酶提取法,物理场辅助提取法等。罗建平等[18]研究用热水提取菠萝皮渣多糖,但是该法提取时间较长,效率不高。严浪等[19]和吴靖等[20]研究用碱法提取菠萝皮渣半纤维素多糖并分析其性质。郭巧玲等[21]研究用热水提取菠萝皮渣粗多糖及其抗氧化性能,但是提取效率也不高。超声波辅助提取技术因其低能耗和高得率而在近年被广泛应用[22]。

为了提高菠萝皮渣多糖的提取效率,本研究将超声波辅助提取技术应用于菠萝皮渣多糖的提取,并优化提取工艺条件,在获得多糖的基础上,进一步研究其抗氧化活性。为菠萝的深加工和副产物的充分利用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菠萝皮渣(九成熟)产地湛江雷州,制作菠萝罐头剩下的皮渣,由广东收获罐头食品有限公司提供。

无水葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司;牛血清蛋白 分装进口;考马斯亮蓝G-250 天津市科密欧化学试剂开发中心;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH自由基) Sigma公司分装产品;邻二氮菲、抗坏血酸、硫酸二铁(Ⅲ)铵、苯酚 广东化学试剂厂;其他化学试剂均为分析纯。

SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机(总功率950 W) 宁波新芝生物科技股份有限公司;80-2型电动离心机 金坛市新航仪器厂;FA1004N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;V-1100D型可见风光光度计 上海美谱达仪器有限公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;CG001型德尔粉碎机 广东德尔电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 取菠萝皮渣,剔除大颗粒杂质,置于烘箱中55±0.2 ℃干燥8 h,经粉碎机粉碎后过60目筛,得粉末状菠萝皮渣,储存备用。

1.2.2 超声波辅助提取菠萝皮渣多糖的工艺 参考罗建平等[18]方法,并进行适当修改。称取菠萝皮渣干粉2 g,按料液比要求加入适当蒸馏水并混合,设定超声功率、超声时间后进行超声提取,提取液离心:3500×g,15 min,取上清液浓缩10 min,浓缩液与Sevage试剂混合,振摇30 min后离心:3500×g,15 min,取上清液,与3倍上清液体积的95%乙醇溶液混合,室温下静置沉淀30 min后离心:3500×g,15 min,取沉淀,蒸馏水重新溶解沉淀,得菠萝皮渣多糖。

1.2.3 多糖含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的制作 参考王文平等方法[23]。分别取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的0.04 mg/mL葡萄糖标准液,置于10 mL具塞试管中,加水至2.0 mL,加入6%苯酚1.0 mL,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0 mL,静置5 min,沸水浴20 min,迅速冷却至室温(约25 ℃),在490 nm处测其测吸光度。

1.2.3.2 多糖换算因子的测定 准确称取37 ℃干燥后的菠萝皮渣多糖30.56 mg,蒸馏水溶解,定容至100 mL。吸取多糖溶液1.0 mL,按上述操作步骤,测吸光度,将吸光度值带入回归方程计算供试品中葡萄糖质量体积,根据下式计算换算因子F。

式(1)

式(1)中,W为多糖的质量(mg),C为多糖液中葡萄糖质量体积(mg/L),V为多糖体积(L),D为多糖稀释倍数。

1.2.3.3 样品多糖含量的测定 取样品溶液1.0 mL,按上述操作步骤,测吸光度。按标准曲线和下式计算多糖含量。

式(2)

式(2)中,C为样品液中所测葡萄糖的质量体积(mg/L);D为样品液的稀释倍数;V为溶液体积(L);F为换算因子;M为菠萝皮渣干粉质量(mg)。

1.2.4 多糖提取单因素实验

1.2.4.1 提取时间对菠萝皮渣多糖得率的影响 在料液比1∶35,温度45 ℃,功率比50%的条件下,探讨不同提取时间(20、25、30、35、40 min)对菠萝皮渣多糖得率影响。

1.2.4.2 温度对菠萝皮渣多糖得率的影响 在提取时间20 min,料液比1∶35,功率比50%的条件下,探讨不同温度(45、50、55、60、65 ℃)对菠萝皮渣多糖得率影响。

1.2.4.3 超声波功率对菠萝皮渣多糖得率的影响 在提取时间20 min,温度45 ℃,料液比1∶35的条件下,探讨不同功率比(45%、50%、55%、60%、65%)对菠萝皮渣多糖得率影响。

1.2.4.4 料液比对菠萝皮渣多糖得率的影响 在提取时间20 min,温度45 ℃,功率比50%的条件下,探讨不同料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50)对菠萝皮渣多糖得率影响。

1.2.5 多糖提取正交实验 在单因素实验结果的基础上,选取四因素三水平做正交实验,因素水平表如表1所示,通过直观分析法得到影响多糖得率因素的主次顺序和最佳提取工艺参数,并用方差分析分析其结果。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

1.2.6 菠萝皮渣多糖的抗氧化性研究

1.2.6.1 羟自由基(·OH)清除能力的测定 采用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系[24]进行实验。

1.2.6.2 DPPH自由基(DPPH·)清除能力的测定 参考Wang等[25]方法。取1.0 mL多糖样品溶液于具塞试管中,加入3.0 mL DPPH乙醇溶液,混合均匀,室温下于黑暗处静置60 min后,测其517 nm处吸光度值,同时测定多糖样品空白以及不加多糖样品的空白样的吸光度值。同时以不同浓度的VC溶液作阳性对照实验。按下式计算其对DPPH·清除率。

式(3)

式(3)中,I为清除率(%);Ai为3.0 mL DPPH溶液+1.0 mL样品液的吸光度值;Aj为1.0 mL样品液+3.0 mL 无水乙醇的吸光度值;A0为3.0 mL DPPH溶液+1.0 mL样品溶剂的吸光度值。

1.2.6.3 还原能力的测定 参考罗建平等[18]方法,并进行适当修改。分别取1.0 mL 5×10-3mol/L邻二氮菲溶液于若干具塞试管中,各加入0.5 mL 0.002 mol/L Fe3+溶液,摇匀,分别加入1.0 mL多糖样品溶液,迅速补水至7.0 mL,摇匀,30 ℃水浴1 h后在536 nm波长下测其吸光度。同时测定多糖样品空白以及不加多糖样品的空白样的吸光度值。以不同浓度的VC溶液作阳性对照实验。按下式计算样品还原能力。

式(4)

式(4)中,A样品为1.0 mL邻二氮菲+0.5 mL Fe3++1.0 mL样品的吸光度值,A对照为1.0 mL样品+0.5 mL Fe3+的吸光度值,A空白为1.0 mL邻二氮菲+0.5 mL Fe3+的吸光度值。

1.3 数据统计分析

以上实验均平行3次,根据三次实验结果计算相应的标准偏差。结果以均值或均值(标准偏差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助提取菠萝皮渣多糖的工艺

2.1.1 多糖含量测定标准曲线 以吸光度为纵坐标,标准葡萄糖溶液浓度为横坐标,所得其线性回归方程为y=0.0561x-0.0009,相关系数为0.9988,线性关系良好。说明在测定的浓度范围内,制作的标准曲线准确度较高,可以用于样品多糖含量的测定。根据该方程,可以计算出样品中含有的多糖质量,再结合式(2)可以计算出多糖的得率。

2.1.2 单因素实验结果

2.1.2.1 提取时间对菠萝皮渣多糖得率的影响 图1为提取时间对菠萝皮渣多糖得率的影响结果。由图1可知,菠萝皮渣多糖得率随提取时间增加而升高。然而,多糖得率随时间增加而升高的幅度不大,同时,当时间大于30 min时,多糖得率虽仍呈升高之势,但趋势不明显。可能由于在前30 min内,绝大部分菠萝皮渣多糖都能被提取出来,而后再继续增加时间仅有少量的菠萝皮渣多糖被提取出来,故增加幅度不大。而且提取时间的增加会增加更多的能量,造成能量的浪费。因此选择提取时间30、35、40 min三个水平做正交实验。

图1 提取时间对菠萝皮渣多糖得率的影响Fig.1 Effects of extraction time on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel

2.1.2.2 温度对菠萝皮渣多糖得率的影响 图2为温度对菠萝皮渣多糖得率的影响结果。由图2可知,当温度小于50 ℃时,多糖得率随温度升高而升高,温度在50～60 ℃范围内,多糖得率升高趋于平缓,当温度继续升高,可能由于一方面温度的提高可以提高多糖的溶解度和扩散率,但是温度太高会破坏多糖的结构,引起多糖的降解[22],最终使得温度大于60 ℃时,多糖得率反而降低。故选择温度50、55、60 ℃三个水平做正交实验。

图2 温度对菠萝皮渣多糖得率的影响Fig.2 Effects of temperature on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel

2.1.2.3 超声波功率对菠萝皮渣多糖得率的影响 图3为超声波功率对菠萝皮渣多糖得率的影响结果。由图3可知,当超声功率比由45%增加到60%时,菠萝皮渣多糖的得率逐渐增加。在功率比为60%时,多糖的含量达到最高,而后降低。可能由于在其他条件不变的情况下,超声功率越高,超声波在水介质中产生的空化效应和机械波动效应对细胞壁的破坏作用就越大,多糖也就越容易析出。然而当超声功率过高时可能会导致多糖降解,因而得率会降低。故超声功率比选择为60%左右为宜,选择功率比50%(即功率为475 W)、55%(即功率为523 W)、60%(即功率为570 W)三个水平做正交实验。

图3 功率对菠萝皮渣多糖得率的影响Fig.3 Effects of power on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel

2.1.2.4 料液比对菠萝皮渣多糖得率的影响 图4为料液比对菠萝皮渣多糖得率的影响结果。由图4可见,料液比从1∶25增加到1∶40时,菠萝皮渣多糖得率随着料液比的增加而升高;当料液比大于1∶40时,多糖得率升高不明显,趋于平缓。可能由于料液比从1∶25增加到1∶40时,超声波的空化效应使得多糖能更充分的被水提取出来,而后继续增加料液比,多糖的量虽然有增加,但是由于溶剂水也增加较多,相当于对多糖进行了部分稀释,反而不利于多糖的提升,故其总的浓度增加没有特别明显。故选择料液比1∶40、1∶45、1∶50三个水平做正交实验。

表3 正交实验结果方差分析Table 3 Analysis of variance on the result of orthogonal experiment

图4 料液比对菠萝皮渣多糖得率的影响Fig.4 Effects of material to liquid ratio on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel

注：**p<0.01为影响极显著,*p<0.05为影响显著。2.1.3 正交实验结果 在单因素实验的基础上,确定影响菠萝皮渣多糖得率的4个因素3个水平(见表1),采用L9(34)表用进行正交实验,结果见表2。

表2 正交实验及结果Table 2 Orthogonal experiment and its results

从表2的极差分析可知,影响菠萝皮渣多糖得率的因素主次顺序为料液比(A)>功率比(D)>温度(C)>时间(B),最优的参数组合为A3B3C3D3,即料液比1∶50,时间40 min,温度60 ℃,功率比60%。由表3方差分析可知,在菠萝皮渣多糖超声波辅助提取工艺正交实验所选择的因素和水平范围内,A和D因素的影响达到了显著性水平(p<0.05),即料液比和超声功率对菠萝皮渣多糖得率有显著影响,而提取时间和温度对菠萝皮渣多糖得率的影响不显著,方差分析结果与直观分析结果一致。正交实验验证实验结果显示,以料液比1∶50,时间40 min,温度60 ℃,功率比60%的提取参数进行提取,得率为2.38%±0.14%。说明优化后的提取工艺参数,使多糖得率显著(p<0.05)提高。罗建平等[18]采用热水法提取菠萝皮渣多糖,利用三因素二次通用旋转组合实验优化其提取工艺,最佳提取工艺为料液比1∶25 (m/V)、提取时间5 h、提取温度70 ℃,得率为23.72 mg/g,即为2.37%。本实验用超声波辅助水提取仅用40 min就可以达到和热水提取5 h几乎一样的提取效率,可见,超声波提取技术的应用可大大缩短提取时间,降低提取温度,从而提高多糖的提取效率。

2.2 菠萝皮渣多糖的体外抗氧化活性

2.2.1 菠萝皮渣多糖对羟自由基体系的清除能力 图5为菠萝皮渣多糖对羟自由基体系的清除能力实验结果。由图5可知,在1.50～3.50 mg/mL范围内,菠萝皮渣多糖对羟自由基有一定的清除能力,然而,菠萝皮渣多糖在实验浓度范围内对羟自由基的清除率均不高,而且较同浓度的VC低,且随着浓度的增加,其升高的趋势明显低于VC对羟自由基的清除率。罗建平等[18]采用热水法提取菠萝皮渣多糖,在3.0 mg/mL时对羟自由基的清除率为26.12%,而本实验中3.0 mg/mL时对羟自由基的清除率只有18.0%,相对较低,可能由于超声波辅助提取对菠萝皮渣多糖的大分子结构有一定的影响,特别是活性基团。研究表明多糖能清除羟基自由基的机制可能是多糖中的羟基能够贡献一个质子使其与羟基自由基结合,从而达到清除的目的[22]。

图5 菠萝皮渣多糖对羟自由基的清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging capacity of polysaccharides from the pineapple peel

2.2.2 菠萝皮渣多糖对DPPH·清除能力的测定结果 图6为菠萝皮渣对DPPH·清除能力的实验结果。由图6可知,在实验浓度范围内(1.50～3.50 mg/mL),菠萝皮渣多糖对DPPH·的清除效果与浓度有较好的量效关系,多糖浓度(x)与清除率(y)的回归线性方程为y=5.699x+33.262,相关系数为0.9847;VC对DPPH·的清除率均大于90%,可能由于VC在实验浓度范围内对DPPH·的清除反应接近平衡,清除效果与浓度的量效关系不明显;在相同浓度情况下,VC对DPPH·清除率均高于菠萝皮渣多糖,菠萝皮渣多糖清除DPPH·的IC50为2.47 mg/mL。研究认为,一些化合物之所以能清除DPPH·,可能是因为这些化合物能提供一个电子使其与DPPH·的单电子配对,从而使DPPH·的吸收逐渐消失[22]。

图6 菠萝皮渣多糖对DPPH·清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of polysaccharides from the pineapple peel

2.2.3 菠萝皮渣多糖还原能力的测定结果 图7为菠萝皮渣多糖还原能力的测定结果。抗氧化剂的还原力与其抗氧化活性之间存在联系,一般来说,还原力越大,抗氧化性越强。由图7可知,菠萝多糖对Fe3+的还原能力随着浓度的增加而升高,且还原力与多糖浓度呈正相关。在相同浓度下,VC的还原能力均高于菠萝皮渣多糖,如试样浓度为1.5 mg/mL时,VC的还原能力为0.786,多糖仅为0.389。这些结果与罗建平等[18]和郭巧玲等[21]的研究结果基本一致。

图7 菠萝皮渣多糖对铁离子还原能力 Fig.7 Ferric ion reducing capacity of polysaccharides from the pineapple peel

3 结论

采用超声波辅助提取技术提取菠萝皮渣多糖,利用正交设计实验优化其提取工艺,最佳工艺参数为料液比1∶50,时间40 min,温度60 ℃,功率比60%,得率为2.38%。通过比较可知,超声波辅助提取技术的应用可大大缩短提取时间,提高提取效率。

体外模型从·OH的清除能力,DPPH·的清除能力和还原能力三个角度评价菠萝皮渣多糖的抗氧化活性。研究结果表明,在实验浓度范围内(1.50～3.50 mg/mL),菠萝皮渣多糖对·OH的清除率均较低,清除DPPH·的IC50为2.47 mg/mL,表明菠萝皮渣多糖具有一定的抗氧化活性。

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Ultrasound-assisted extraction and antioxidant activities of polysaccharides from pineapple peel

WANG Biao-shi,WU Yi-hua,ZHOU Ze-jie,JIANG Min,HU Xiao-jun, PENG Yuan-huai,YANG Juan,LIU Shu-min

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Lingnan Normal University,Zhanjiang 524048,China)

Using pineapple peel as materials,optimal process conditions of ultrasound-assisted extraction of polysaccharides and its antioxidant activities were studied. Based on the single factor experiment,orthogonal experiment was conducted to optimize the extraction process. The antioxidant activitiesinvitrowere also evaluated in three systems with hydroxyl radical(·OH)scavenging capacity,DPPH free radical(DPPH·)scavenging capacity and reducing capacity. The optimum conditions of pineapple peel polysaccharides were determined as follows:material to liquid ratio was 1∶50,extraction time was 40 min,extraction temperature was 60 ℃,ultrasound power was 60%. Under the optimal conditions,the extraction yield was 2.38%. The scavenging rate on hydroxyl radical(·OH)of the polysaccharides from pineapple peel increased with the increase of polysaccharides concentration(1.5～3.5 mg/mL)and was lower than VCat the same concentration. The polysaccharides from pineapple peel had good DPPH scavenging effect when compared with standard VCand the IC50on DPPH· was 2.47 mg/mL. The reducing capacity on Fe3+increased with the increasing concentration. So,the polysaccharides can be extracted effectively by this method and the polysaccharides have good antioxidant activities. The extraction of active polysaccharides from pineapple peel residue can realize the high value utilization of pineapple resources.

Pineapple peel;polysaccharides;ultrasound-assisted extraction;antioxidant activities

2017-01-13

王标诗(1980- )，男，博士，副教授，研究方向：功能性食品、食品加工及安全，E-mail：hang_kong2002@163.com。

广东省公益研究与能力建设项目(2015A010107015)；岭南师范学院热带与南海资源协同创新中心项目(CIL1503)和岭南师范学院自然科学研究项目(YL1403)联合资助。

TS201.1

B

1002-0306(2017)15-0207-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.039