小麦淀粉加工废水中阿拉伯木聚糖的理化性质及抗氧化活性研究

田贝贝,陈 洁,王远辉

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450001)

小麦淀粉加工废水中阿拉伯木聚糖的理化性质及抗氧化活性研究

田贝贝,陈 洁,王远辉

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450001)

从小麦淀粉加工废水中制备阿拉伯木聚糖(AX),通过激光光散射法和离子色谱法(IC)对其相对分子质量和单糖组分等理化性质进行分析,并采用体外实验研究AX的抗氧化性。研究表明:源自小麦淀粉废水的AX具有较强的还原能力和DPPH自由基清除能力,对羟基自由基清除作用则相对较弱。分级醇沉可以有效分离具有不同分支结构、单糖比例、相对分子质量的AX,其中60%乙醇醇沉AXE纯度较高,纯度为86.81%。分级醇沉AX,随乙醇浓度的增加,目标AX的平均相对分子质量减小,其Ara/Xyl比值及半乳糖(Gal)含量增加。具有不同相对分子质量、分支结构及单糖比例的AX,其对DPPH自由基、羟基自由基清除作用以及还原力不同,分子质量较大且具有较小分支结构的AX具有较强的供氢能力,而络合游离金属离子的能力相对较弱。

小麦淀粉废水,阿拉伯木聚糖,相对分子质量,抗氧化性

小麦是世界上种植最广泛的粮食作物,小麦的传统加工主要是制粉(小麦淀粉和谷朊粉)。小麦淀粉加工工艺主要有面团洗面筋法和三相卧螺分离法,这两种工艺为湿法分离,均会产生高黏度加工废水(戊聚糖浆)。其副产物主要作为动物饲料、肥料、生产酒精的原料或在不能及时销售的情况下进入污水处理系统,既影响企业的经济效益又污染环境。最新发现副产物戊聚糖浆中的阿拉伯木聚糖(AX)有特定的营养功能。AX是非淀粉胶粘性多糖,主要由木糖(Xyl)和阿拉伯糖(Ara)组成,具有肠道益生活性[1-3]、免疫调节活性[4-5]、抗氧化活性[6-8]、降血糖功能[9-10]等,其生物活性与AX相对分子质量有关,且低分子质量AX免疫增强活性较好[5,11]。已有研究表明乙醇分级醇沉具有不同相对分子质量、Ara/Xyl比率及木糖残基取代度的AX是一个非常有效的方法,且Ara/Xyl比率和木糖残基取代度随着乙醇浓度的增加而增加,分级醇沉是基于不同分子质量和分支结构的AX在乙醇中的溶解度不同[12-14]。

氧自由基可进攻生物膜脂质、酶、蛋白质等重要生物大分子,可加速机体衰老,造成机体的损伤和病变。天然抗氧化剂可以清除细胞产生的活性氧自由基从而提高机体的免疫功能[15-16]。因此,天然抗氧化剂的研究愈来愈受到重视,如茶多酚、大豆异黄酮、大豆肽、枸杞多糖等。多糖能清除活性氧自由基,其抗氧化活性已引起人们的关注,相关研究正逐步展开。目前,对AX的研究主要侧重于麸皮多糖的生物活性探索,对小麦淀粉加工废液中分离出的AX相关研究较少,且不够深入,因此本文以其为研究对象,采用激光光散射法和离子色谱法(IC)分析AX的理化性质,通过检测AX对羟基自由基、DPPH自由基的清除能力以及还原能力,对不同分子质量AX的体外抗氧化活性进行研究,为进一步开发具有抗氧化活性的多糖资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦淀粉加工废水 郸城财鑫糖业有限责任公司;木聚糖内切酶 诺维信公司;二苯代苦味酰肼、葡萄糖、间苯三酚、盐酸、冰醋酸、无水乙醇、柠檬酸、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、乙醇、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯化铁、三氯乙酸、重蒸酚、浓硫酸 均为分析纯化学试剂。

TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;DL-5000B-B离心机 上海安亭科学仪器厂;FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;DIONEX ICS-3000 USA离子色谱仪 美国戴安公司;多角度激光光散射仪 Wyatt Technology DAWN EOS。

1.2 实验方法

1.2.1 AX产品的制备 小麦淀粉加工废水(固形物含量为10%)→调节酸度4.0～6.0→添加戊聚糖酶(酶与料液中固形物的质量比为0.1%)→ 50 ℃恒温水浴搅拌1.5 h→离心(4500 r/min,20 min)→上清液→ 90～95 ℃保持25 min→离心→上清液→浓缩醇沉→沉淀物经乙醇洗涤后加水复溶→二次离心(4500 r/min,20 min)→浓缩醇沉→沉淀物冷冻干燥→酶解阿拉伯木聚糖产品。

操作要点:参考Izydorczyk[13]、张晓娜[11]等的方法。初次醇沉时,控制乙醇的最终体积分数为80%以上,得AXE;初次浓缩醇沉时为分级醇沉,依次调整乙醇的最终体积分数为60%和80%,分别得AXE(60%)和AXE(80%)。

小麦淀粉加工废水→二次离心→上清液→浓缩醇沉→沉淀物复溶→离心→上清液→浓缩醇沉→沉淀物冷冻干燥→未酶解阿拉伯木聚糖产品(未酶解AX)。

1.2.2 水分的测定 按GB/T21305-2007谷物及谷物制品水分的测定常规法执行。

1.2.3 戊聚糖含量的测定 间苯三酚法[17]。

1.2.4 总糖的测定 苯酚-硫酸法[11]。

1.2.5 相对分子质量测定 色谱柱:TSK Gel G4000PWxl;流动相:0.1 mol/L NaCl;流速:0.5 mL/min;进样量:200 μL;样品浓度:1 mg/mL。

1.2.6 单糖组成分析 色谱柱:分析柱:Carbo PacTMPA20,3 mm×150 mm Analytical。淋洗液:250 mmol/L NaOH和1mol/L NaAC;流速:0.5 mL/min;进样体积:10 μL;柱温:35 ℃;检测器:脉冲安培检测器,金电极。梯度洗脱条件:A为超纯水,B为250 mmol/L NaOH,C为1 mol/L NaAC。0～20 min:94% A,6% B,0% C。20～20.1 min:89% A,6% B,5% C。20.1～35 min:74% A,6% B,20% C。35.1～45 min:20% A,80% B。45.1～55 min:94% A,6% B。

样品前处理:精确称量试样10 mg于水解管中,加入4 mL三氟乙酸(4 mol/L),充氮1 min排出管内空气,旋紧螺旋盖,于120 ℃水解2 h,待冷却后氮气吹干水解液,除去过量的三氟乙酸,加超纯水定容至10 mL。稀释后,0.2 μm滤膜过滤,进样。

1.2.7 清除DPPH自由基能力的测定 参照DPPH比色法[18],于离心管中加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH-95%乙醇,3 mL样品,摇匀后放置0.5 h,离心(4500 r/min,2 min),取上清液在517 nm下测其吸光度A0、A1、A2。

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

式(1)中A0:DPPH+蒸馏水;A1:DPPH+样品;A2:95%乙醇+样品。

1.2.8 清除羟自由基能力的测定 参照水杨酸比色法[19]。于离心管中依次先加入0.5 mL 9.1 mmol/L乙醇-水杨酸,0.5 mL样品,0.5 mL 9.1 mmol/L FeSO4,3.5 mL蒸馏水,再加入5 mL 8.8 mmol/L H2O2后摇匀,37 ℃水浴加热15 min,离心(4500 r/min,2 min),取上清液在510 nm下测其吸光度A0、A样。

羟自由基清除率(%)=(A0-A样)/A0×100

式(2)

式(2)中A0:以水代替样品,为空白样测定值;A样:样品测定值。

1.2.9 多糖还原力的测定 精确称量AX样品,以蒸馏水为溶剂,制备不同浓度的多糖溶液。参照文献[20]方法测定多糖的还原力,以蒸馏水为空白对照。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 20分析软件对实验数据进行统计分析,以p<0.05为显著性标准,利用Excel 2010制作图表。

2 结果与讨论

2.1 相对分子质量分布

小麦淀粉加工废水(戊聚糖浆)受其高黏度的限制,难以分离、提纯具有抗氧化活性的阿拉伯木聚糖(AX),因此,木聚糖内切酶用于降低戊聚糖浆的黏度[21]。表1可知,未酶解AX、酶解AX(AXE)、AXE(60%)、AXE(80%)四种AX产品的平均相对分子质量依次减小。由于AX由主链木聚糖和侧链阿拉伯糖连接而成,木糖残基、阿拉伯糖分别经β-(1,4)糖苷键连接形成AX的主、侧链。木聚糖内切酶可以攻击木聚糖主链,随机切断β-(1,4)糖苷键,使AX解聚,生成可以取代低聚木糖的混合物,相对分子质量降低[12,22]。因此,未酶解AX平均相对分子质量大于酶解AX产品。乙醇分级沉淀AXE,由于不同分子质量的AX在乙醇中的溶解度不同,随乙醇浓度的增加,所得AX的平均分子质量减小,故80%乙醇醇沉AXE的平均相对分子质量相对较小。

表1 AX相对分子质量分布Table 1 Mw distribution of AX

表2 AX单糖组成分析Table 2 Monosaccharide compositions of AX

注：各指标的测定均取三次测定的平均值。)

2.2 单糖组成分析

由表2可知,四种AX产品的组成基本相似,AXE(60%)纯度较高,蛋白质含量为5.68%,而AXE(80%)的纯度相对较低。除AXE(60%)外其它三种AX产品均含有大量蛋白质,尤其是AXE(80%)蛋白质含量更高。从AX的单糖组成分析可知,AX主要由阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)组成,含有部分葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal),而AXE(60%)与AXE(80%)的单糖组分之间的比例有很大差异,AXE(80%)中含有较多的Gal,而AXE(60%)中Gal的比例则很小。Jelaca[23]指出,阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯木聚糖是面粉中水溶性戊聚糖的主要组成成分,这说明小麦淀粉加工废水中可能也含有阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯木聚糖两种多糖。而在AXE(60%)中阿拉伯半乳聚糖的含量较少,且其Ara/Xyl比值较AXE(80%)小。另外,通过乙醇分级沉淀AXE,随乙醇浓度的增加,Ara/Xyl和木糖残基取代度随之增加。这是由于分级醇沉是基于不同分子量和分支结构的AX在乙醇中的溶解度不同及阿拉伯糖残基在木糖主链上的取代度不同。本实验结果表明,通过60%乙醇和80%乙醇分级沉淀AXE,可以有效分离具有不同相对分子质量、分子结构及单糖比例的AX。

2.3 AX抗氧化活性研究

2.3.1 清除DPPH自由基能力的测定 图1表明,源自小麦淀粉加工废水的酶解AX与未酶解AX对DPPH自由基都具有一定的清除作用,且清除率与AX浓度之间存在一定的剂量关系,AX浓度越大,其对DPPH自由基的清除作用越强。由表3可以看出,4种AX产品对DPPH自由基的清除能力由低到高依次为未酶解AX、AXE(60%)、AXE、AXE(80%)(平均相对分子质量依次减小),其IC50分别为4.18、3.33、2.85、1.85 mg/mL。AXE(80%)清除DPPH自由基的能力最强,其平均相对分子质量较小且具有较高的分支结构(Ara/Xyl为0.88)。张晓娜[11]研究表明,麸皮酶解AX产品中以AXE(80%)对DPPH自由基的清除效果最好,其IC50为0.58 mg/mL,与本研究结果相似。由此可知,DPPH自由基的清除能力与AX的平均相对分子质量有关,也可能与AX的分支结构和木糖残基取代度有关,由于多糖的分支结构、取代基及相对分子质量都会影响其活性[24]。

图1 AX对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging capacity of DPPH free radicals by AX注：不同字母表示差异显著(p<0.05)，图2、图3同。

抗氧化能力IC50值(mg/mL)未酶解AXAXEAXE(60%)AXE(80%)DPPH自由基4.182.853.331.85羟基自由基18.2139.9432.1765.45

2.3.2 清除羟自由基能力的测定 生物体内存在游离金属离子,如铁离子,能够催化H2O2生成羟自由基,导致相邻分子损伤,而抗氧化剂能够络合Fe3+减少羟自由基的产生[25-26]。图2可见,AX对羟自由基的清除作用随其浓度的增加呈缓慢上升趋势。由表3可知,未酶解AX对羟自由基的清除能力相对较强,其IC50为18.21 mg/mL;AXE(60%)、AXE、AXE(80%)对羟自由基的清除作用依次降低,IC50分别为32.17、39.94、65.45 mg/mL。AXE(60%)与AXE对羟自由基的清除能力接近的原因在于当乙醇浓度达到60%时,除极少量小分子质量AX外,大量AX可以析出,即AXE(60%)在AXE中所占比例较大。AXE(80%)对羟自由基的清除作用较低,原因可能还在于其杂质(蛋白质26.77%)的干扰,影响吸光度测定,导致吸光值偏大,清除率偏低。

图2 AX对羟自由基的清除率Fig.2 Scavenging capacity of hydroxyl radicals by AX

2.3.3 多糖还原力的测定 生物体内存在游离金属离子,如铁离子,通过Fe3+被抗氧化剂还原成Fe2+来测定抗氧化剂的还原力,还原能力愈强,其抗氧化活性愈好[27-28]。AX的还原能力如图3,与清除DPPH自由基和羟基自由基能力相似,随所测样品浓度的增加,AX的还原能力增强。平均分子质量相对较小的AX(80%)具有较强的还原能力,AXE、未酶解AX、AXE(60%)的还原能力依次降低。结合表1可知,具有较强还原力的AX(80%)的Ara/Xyl比值为0.88,而还原力相对较弱的AXE(60%)的Ara/Xyl比值为0.77。因此,AX产品的还原能力既与多糖的相对分子质量有关,也可能受其Ara/Xyl比值和木糖残基取代度的影响。

图3 AX还原能力分析Fig.3 Reducing power of AX

3 结论

本实验结果表明,木聚糖内切酶可以用于提取具有较高纯度的AXE(60%),另外,乙醇分级沉淀AX,可以有效分离具有不同相对分子质量、分支结构及单糖比例的AX产品。四种AX产品具有很强的还原能力和DPPH清除能力,对羟自由基清除作用相对较弱。原因在于抗氧化剂对羟自由基清除能力与DPPH自由基清除能力、还原力三者作用机理不同,DPPH自由基清除能力和还原力的测定是基于电子转移,抗氧化剂通过自身的供氢能力给出电子,达到还原游离金属离子和自由基的目的,而对羟自由基的清除作用属于络合机理[29]。四种AX对DPPH自由基、羟基自由基清除作用以及还原力不同的原因在于其相对分子质量、分支结构及单糖比例之间的差异,具有较高分支结构且较小相对分子质量的AX具有较强的供氢能力,而络合游离金属离子的能力相对较弱。因此,分级醇沉可以有效筛选出具有目标抗氧化活性的AX产品。本研究为小麦淀粉加工废水的开发利用价值提供理论参考,为具有抗氧化活性的多糖资源的开发提供新方向。

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Study on physicochemical properties and antioxidant activity of Arabinoxylan from wheat starch wastewater

TIAN Bei-bei,CHEN Jie,WANG Yuan-hui

(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

Arabinoxylan were prepared from wheat starch wastewater. The physicochemical properties and antioxidant activity of AX were analyzed by laser light scattering method,IC andinvitroexperiments. The results showed that the AX from wheat starch wastewater had a strong reducing ability and a scavenging capacity of DPPH free radicals,while the ability of scavenging hydroxyl radical of AX was relatively weak. Ethyl alcohol fractionation precipitation can effectively separate the AX with different degree of branching,monosaccharide ratio and molecular weight. The AXE(60% ethyl alcohol precipitates)had higher purity(86.81%). The galactose(Gal)content and ratio of Ara/Xyl of AX increased with the increasing concentrations of ethanol,while the molecular weight decreased. The molecular weight,branched structure and monosaccharide ratio of AX played an important role in antioxidant activity. The AX with low molecular weight and a higher degree of branching showed a greater capability to provide hydrogen atoms,while the ability to complex free metal ions was relatively weak.

wheat starch wastewater;arabinoxylan;Mw;antioxidant activity

2017-01-17

田贝贝(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工与品质检测，E-mail:15703887555@163.com。

以小麦副产物生产阿拉伯木聚糖的优化合作研究项目(2015DFA30380)。

TS249.9

A

1002-0306(2017)15-0040-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.009