一株苯酚降解菌分离及降解特性研究

杨世东，孔 龙，廖路花，陶文鑫，姚丽强，张星楠

(东北电力大学 建筑工程学院，吉林 吉林 132012)

一株苯酚降解菌分离及降解特性研究

杨世东，孔 龙，廖路花，陶文鑫，姚丽强，张星楠

(东北电力大学 建筑工程学院，吉林 吉林 132012)

从实验室模拟煤化废水处理装置的好氧段取污泥，先利用含苯酚的富集培养基筛选出对苯酚具有良好耐受性能的菌株(记为JX，JY，JZ)；再利用以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基，从以上三种菌株中筛选出一株对苯酚具有良好降解性能的菌株(JY)。对JX，JY，JZ的培养特征以及生理生化特征进行观察与鉴定。将菌株JY进行了16S rDNA基因序列的测定，最终确定该菌株为不动杆菌属(Acinetobacter)。并研究了菌投加量、温度、pH、以及摇床转速对JY的生长量以及酚降解率的影响。结果表明：菌株JY的最佳菌投加量为3%，最适温度为30 ℃～35 ℃，最佳pH为7.0，最佳摇床转速为120 r/min。

苯酚降解；棒杆菌属；遗传学与基因；降解特性

苯酚是造纸、炼焦、塑料等工业废水中主要的污染物，其具有难降解、毒性大的特点[1-3]。处理煤化废水中酚类物质的方法当中，生物法较物理法[4]、化学法来说[5]，具有高效、经济的优点。所以筛选出高效降酚菌是目前国内外研究学者研究的工作重点，以达到优化降酚菌群的目的。目前，国内外研究学者已经筛选出很多苯酚降解菌，如假单胞菌(Pseudomonas sp.)，芽孢杆菌(Bacillus sp.JY01)，鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii UWT)，杆菌株菌株(GXY-1)等[6-8]。可是上述降酚菌对高浓度苯酚的耐受性均不高，且很少有学者在筛选出苯酚降解菌之后，继续探究其对其他酚类的耐受性及降解性能。因此，本研究希望通过两批次的筛选，筛选出对苯酚具有较高耐受性的降酚菌，同时对其它酚类的耐受性及降解性能进行研究探讨，为其在实际煤化废水处理中能达到更好的效果提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌源

实验室模拟煤化废水处理装置好氧段的污泥[9]。

1.1.2 培养基

富集培养基[10]：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，蒸馏水1 000 mL。

含苯酚培养基：在富集培养基的基础上，根据实际所需要的苯酚量进行相应的添加。

无机盐培养基[11]：NH4CL 1 g/L，K2HPO40.6 g/L，MgSO40.6 g/L，FeSO43 mg/L，蒸馏水1 000 mL。

苯酚唯一碳源培养基：在无机盐培养基的基础上，根据实际所需要的苯酚量进行相应的添加。

每一种培养基在配置好后，应将pH调节到7.0～7.2，且若需相应的固体培养基，则在其原来的基础上加入18 g～20 g的琼脂粉。

1.1.3 仪器

HZQ-X300恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司)，WFZ-UV3802H紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)，SPX-150B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限医疗设备厂)，SW-CJ-21-D净化工作台(上海博讯实业有限医疗设备厂)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分离、纯化

(1)菌种的富集

通过在实验流程的好氧段取污泥5 g，加入一定量的去离子水，放在磁力搅拌器上搅拌10 min，静置5 min后取其上清液。吸取5 mL上清液，置入富集培养基中，在30 ℃，130 r/min条件下进行连续富集培养24 h[12-13]。

(2)分离与纯化

在无菌操作下，用接种环将无机盐培养的最终菌液挑去少许，画线于琼脂平板上，于30摄氏度的条件下在生化培养箱中培养24 h。为了使菌株更加纯化，用平板培养基再转接分离2次。第1批筛选：以含高浓度苯酚培养基进行筛选，此轮筛选出的包括所有耐酚的细菌(能以苯酚为碳源的和不能以苯酚为碳源的菌种)，筛选出2～3种；第2批筛选：用以苯酚为单纯碳源的培养基对第1批的2-3种细菌进行二次筛选，此轮筛选出来的就是能以苯酚为单一碳源的菌种。

被第2轮筛选掉的就是不能以苯酚为碳源但是对苯酚耐受的菌种。

1.2.2 菌株的鉴定

在实验室条件下，通过观察对得到的菌株进行培养特征的鉴定[13]，在对其进行传统的生理生化性能的鉴定，完成初步鉴定[14]。其遗传学与基因的鉴定委托于上海生物工程有限公司进行鉴定。

1.2.3 苯酚浓度的测定

采用4-氨基安替比林直接光度法[15]。

1.2.4 菌株的生长曲线

利用接种环向富集培养基当中接入适量菌体，置入恒温振荡培养箱中进行振荡培养，温度为30 ℃，转速为130 r/min，每3小时取一定的菌液，对其吸光度OD进行测量，绘制菌株JY的生长曲线[16-17]。

1.2.5 菌株降解特性

对所得的最终菌种，在初始苯酚浓度为1 000 mg/L条件下，探究不同菌投加量、温度、pH、摇床转速对其降解性能的影响，恒温振荡培养箱培养24h后，测OD值以及苯酚降解率[18-19]。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选和鉴定

2.1.1 菌株的筛选

通过第一批筛选得到三株菌，记为JX、JY、JZ。其中三株对苯酚的耐受性为2 000 mg/L。通过第二次筛选，确定上述三株菌中，JY菌可以以苯酚为唯一碳源。

2.1.2 菌株培养特征的鉴定

对三株菌进行培养特征的鉴定，结果见表1，图1为显微观察图。其中图1(a)、图1(b)、图1(c)分别为JX、JY、JZ的显微观察图。

表1 菌落形态特征和显微观察

图1 菌株显微观察

2.1.3 菌株生理生化特征的鉴定，结果见表2。

表2 生理生化试验结果

查阅《常见细菌鉴定手册》初步鉴定菌株JY为不动杆菌(Acinetobacter)。

根据鉴定结果，通过委托上海生物工程有限公司对菌株JY进行16S rDNA分子鉴定，最终确定JY为Comamonas testosteroni，相似性为99%，登录号CJ568123。

图2 菌株生长曲线

图3 菌投加量对苯酚降解性能的影响

图4 温度对降解率的影响

2.2 菌株生长曲线

绘制的生长曲线，如图2所示。由图2可知，在富集培养基当中，苯酚降解菌JY前6个小时，处于延迟期阶段，之后就开始进入到迅速生长的时期，在这个时间段内，菌株JY的生长活性最好，所以在之后的各种降解实验当中，选取这个时间段内的菌株作为研究对象。在12个小时之后，菌株的生长开始进入到稳定增长阶段。在18个小时之后，菌体开始出现部分的死亡。当出现一部分的菌株死亡之后，营养物质对于剩下的菌株来说，相对足够，所以在21小时之后，菌体数量又出现一点的增长。之后又开始出现部分菌株的死亡，这是由于生长物质又开始出现不足的现象。

2.3 各因素对苯酚降解性能的影响

2.3.1菌投加量对苯酚降解性能的影响

在无菌操作条件下，取对数期菌株JY，按不同的接种量接入到苯酚无机盐培养基当中，置入恒温培养箱进行振荡培养。初始苯酚含量为1 000 mg/L，接种量为分别为1%，3%，5%，7%，9%，11%。在30 ℃情况下，恒温振荡培养24 h后，测其剩余苯酚浓度，结果如图3所示。

由图3可知，在接种量为1%时，菌株的潜伏期过长，不利于苯酚的降解。随着菌投加量的逐渐增加，菌株JY对苯酚的降解率也在慢慢的提高。当接种量达到5%时，降解率也达到了最大，计为93.08%。此时，继续增加菌投加量时，降解率则随之逐渐又略微的下降，这是由于投加的菌量过多，而培养基中的营养物质又相对不足，菌株菌体之间对营养物质的竞争较为激烈，进而对苯酚的降解有所影响。因此，菌株JY的最佳接种量为5%，并以此接种量进行接下来的各种特性研究。

2.3.2 温度对苯酚降解性能的影响

在无菌操作条件下，取对数期菌株JY按接入到初始苯酚含量为1 000 mg/L的苯酚无机盐培养基中，接种量为5%，在不同温度下进行振荡培养，温度分别为15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，置入恒温培养箱进行振荡培养24 h后，测其剩余苯酚浓度以及OD值，结果如图4所示。

由图4可知，温度的不同，对JY菌的影响较大，通过进行24 h的降解实验之后，该菌株对苯酚进行降解率较好的温度范围为30 ℃～35 ℃，降解率最高可达92.33%。与此同时，菌液的浓度也相对较高。所以，30 ℃～35 ℃为该菌株的最适浓度范围。在温度为40 ℃时，由于环境温度过高，菌株的蛋白质或核酸发生变质，酶的活性受到影响，从而影响了苯酚的降解效率，同时伴有一部分菌株的死亡。

图5 pH对苯酚降解性能的影响

2.3.3 pH对苯酚降解性能的影响

在无菌操作条件下，取对数期菌株JY按接入到不同的pH培养基中，置入恒温培养箱进行振荡培养。初始苯酚含量为1 000 mg/L，接种量为5%，pH分别为3.0，5.0，7.0，9.0，11.0。在30 ℃情况下，恒温振荡培养24后，测其剩余苯酚浓度以及OD值，结果如图5所示。

由图5可知，该菌株在pH为7.0-9.0之间时，菌株的生长状况良好，在强酸或者强碱环境当中，菌株的生长状况受到影响。在pH为7.0时，降解率达到最高，计为93.46%。那么为保证良好的降解性能，在实际进行水处理时，pH最好调节到7.0左右。

2.3.4 摇床转速对苯酚降解性能的影响

在无菌操作条件下，取对数期菌株JY，按5%的接种量接入到苯酚无机盐培养基当中，置入恒温培养箱进行振荡培养。初始苯酚含量为1 000 mg/L，摇床转速为分别为60 r/min，90 r/min，120 r/min，150 r/min，180 r/min。在30 ℃情况下，恒温振荡培养24 h后，测其剩余苯酚浓度及OD值，结果如图6所示。

图6 摇床转速对苯酚降解性能的影响

在最开始摇床的转速为60 r/min时，苯酚的降解效率以及菌株的生长速度都较为缓慢，对苯酚的降解率只有1.35%。随着摇床转速的不断提高，菌株JY对苯酚的降解率也在不断的提高。在转速为60 r/min～120 r/min之间时，菌株对苯酚的降解率升高的速度相对较高。当摇床转速超过120 r/min时，菌株对苯酚的降解效率的升高速度和增长的速度较之前相对来说较为缓慢，这可能是由于培养基当中的溶解氧量已经接近或者达到了饱和状态。

3 结 论

高效生物降解工艺的开发还需要更进一步的获得高效降解菌，这是因为在实际的煤化废水处理过程当中，各个微生物之间的相互作用也及其复杂，有竞争也有协同，对外界环境改变的适应性也都不同。所以，在实验室获得的菌株能否在实际的废水处理当中获得优势，以及与其他微生物相互组合成高效的菌体组合等还需要进一步的进行研究。本文最终筛选出来的苯酚高效降解细菌JY，其与其他微生物的相互作用、底物利用范围等仍有待研究。

[1] 吴高明.焦化废水(液)物化处理技术研究[D].武汉：华中科技大学，2006.

[2] 马东祝，张玲，黄渊，等.膜生物反应器在焦化废水处理中的应用[J].煤炭技术，2011，30(8)：250-251.

[3] 王喜全，胡筱敏，马英群，等.焦化废水中氨氮及 COD 降解技术[J].环境工程，2011，29(1)：5-7.

[4] 杨世东，廖路花.煤气化废水氨氮吹脱去除因素的影响探究[J].东北电力大学学报，2015，35(2)：5-9.

[5] 由培远，陆晓华.焦化生化外排水电絮凝和化学混凝的深度处理[J].环境科学与技术，2010,33(6E)：337-340.

[6] Y.Cheng，W.Fang，L.Guo.Coking wastewater treatment using a magnetic porous ceramsite carrier[J].Separation and Purification Technology，2014，130：167-172.

[7] Y.Lv，Y.Wang，M.Shan，et al.Denitrification of coking wastewater with micro-electrolysis[J].Journal of Environmental Sciences，2011，23：128-131.

[8] H.Zhuang，H.Han，S.Jia，et al.Advanced treatment of biologically pretreated coal gasification wastewater using a novel anoxic moving bed biofilm reactor (ANMBBR)-biological aerated filter (BAF) system[J].Bioresource Technology，2014，157(4)：223-230.

[9] 杨世东，孔龙，廖路花，等，无机碳源对煤气化废水厌氧段处理效能影响[J].东北电力大学学报，2017，37(2)：59-65.

[10] 周静，李素芹，裴琦.新物化法深度处理焦化废水[J].环境污染与防治，2009，31(9)：64-67.

[11] 乔楠，郭威，于大禹.固定化基因工程菌应用于水环境污染治理研究进展[J].东北电力大学学报，2010，30(2)：21-24.

[12] 丁丽，单德鑫，邢磊，等.SBR工艺处理煤气废水的最佳运行参数的研究[J].东北农业大学学报，2009，40(11)：52-55.

[13] 乔楠，高明星，樊雪.应用于废水处理的油脂酵母分离回收方法研究进展[J].东北电力大学学报，2016，36(5)：63-67.

[14] 蔡妙英，东秀珠.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[15] 国家环保局.水质挥发酚的测定 4-氨基安替比林分光光度法(HJ 503-2009) [S].北京：中国环境科学出版社，2009.

[16] 张孝龙，武仕敏，赵江源，等.两株高效苯酚降解菌的筛选、鉴定及生物强化-DTRO组合工艺初步验证[J].微生物学通报，2014，41(11)：2264-2274.

[17] 王春荣，高振凤，王建兵，等.焦化废水处理系统中苯酚降解菌及其动力学研究[J].工业水处理，2013，33(6)：25-28.

[18] 周林，朱爽，陈木华，等.焦化废水中4株苯酚高效降解菌的分离及鉴定[J].生物技术，2010，20(2)：44-46.

[19] 周倩倩，丁丛，王治平，等.苯酚降解菌的筛选及其降解特性初探[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2011，27(4)：544-549.

Isolation and Degradation Characteristics of a Phenol Degradation Bacterium

Yang Shidong，Kong Long，Liao Luhua，Tao Wenxin，Yao Liqiang，Zhang Xingnan

(School of Civil Architecture Engineering,Northeast Electric Power University，Jilin Jilin 132012)

The sludge is taken from the experimental aerobic stage of the simulated coal chemical wastewater treatment plant.Firstly，strains with good tolerance to phenol (JX，JY，JZ) were screened out by enrichment medium containing phenol.Then，a strain (JY) with good degrading ability to phenol was screened from the above three strains by using the inorganic salt medium with phenol as sole carbon source.The culture characteristics and physiological and biochemical characteristics of JX，JY and JZ were observed and identified.The strain JY was determined by 16S rDNA gene sequence.Finally，the strain was identified as Acinetobacter.The effects of the dosage of bacteria，temperature，PH，and the rotation speed on the growth of JY and the degradation rate of phenol were studied.The results showed that the optimal dosage of JY was 3%，the optimum temperature was 30 ℃-35 ℃，the optimum pH was 7.0，and the optimum rotational speed was 120r/min.

Phenol degradation；Corynebacterium；Genetics and genes；Degradation characteristics

2017-03-12

吉林省科技发展计划项目(20130206006SF)

杨世东(1978-)，男，博士，副教授，主要研究方向：城市污水生物处理技术、水处理高级氧化技术.

1005-2992(2017)04-0074-06

X703

A

电子邮箱： 793516890@qq.com(杨世东)；953334012@qq.com(孔龙)；1329689755@qq.com(廖路花)；837800577@qq.com(陶文鑫)；84717305@qq.com(姚丽强)；316738001@qq.com(张星楠)