DNA分子标记技术及其在啤酒大麦品种鉴定中的应用

陈 萍，李盼畔，麦丽珊，刘姣姣，何翠霞，赵淑嘉，吴小瑶，陈 颖

(南沙出入境检验检疫局综合技术服务中心，广东 广州 511400)

DNA分子标记技术及其在啤酒大麦品种鉴定中的应用

陈 萍，李盼畔，麦丽珊，刘姣姣，何翠霞，赵淑嘉，吴小瑶，陈 颖

(南沙出入境检验检疫局综合技术服务中心，广东 广州 511400)

简单对比了常用的大麦品种鉴定方法以及归纳DNA分子标记技术的分类，进一步通过综述几种常用 DNA分子标记技术的原理、优缺点及其在大麦品种及纯度鉴定上的应用情况，以期为DNA分子标记在啤酒大麦品种及纯度鉴定研究提供参考。

DNA分子标记；啤酒大麦；品种鉴定

啤酒大麦是啤酒生产的主要原料，大麦的质量直接影响啤酒的品质和口感；而大麦的质量受品种、产区、气候条件等因素的影响，大麦不同品种之间的淀粉、蛋白质、β-葡聚糖以及酶系活性等均存在一定差异，这些差异直接影响麦芽制造和啤酒酿造工艺。因此，大麦品种的真实性及纯度是啤酒酿造的关键。

目前，我国已成为世界上最大的啤酒生产国[1]。随着我国啤酒产量的不断增长，国产大麦产量及质量难以满足市场需求，啤酒大麦的进口量迅猛增长，位列进口谷物前3位，2013～2014年度进口量达到历史最高的489.1万t[2]。近年来，我国啤酒大麦进口国主要为澳大利亚、加拿大和法国；其中，澳麦的品种主要有gairdner、baudin、vlamingh等，加麦的品种主要有metcalfe、copland、major等，法麦的品种主要有sebastian、tipple、cerviose等。在国际贸易中，大麦品种是优质优价的，不同品种的每吨价格相差数十美元；一般情况下，买卖双方在贸易合同中对大麦品种以及品质指标等进行标注和规定，如果进口大麦出现品种或纯度与合同规定的不符，则会使我国在对外贸易中蒙受直接的经济损失，也间接给啤酒酿造业带来经济损失。因此，品种鉴定是进口大麦品质检验中很重要的项目指标。另外，在国内市场上，由于生产和经营管理不规范等因素，啤酒大麦出现以次充好等掺假情况，严重影响了我国啤酒产业健康发展。因此，开展品种鉴定工作对于避免贸易经济损失、保证啤酒大麦质量及提高啤酒酿造业的生产效益等方面具有重要意义。

近年来，国内外对大麦品种的真实性及纯度鉴定技术研究在不断发展，在简要比较常用的大麦品种鉴定方法的基础上，进一步对DNA分子标记技术中常用的RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP标记的原理及其在大麦品种及纯度鉴定上的应用作一简述，为大麦品种及纯度鉴定技术选择及研究提供一些参考。

1 大麦品种鉴定方法的比较

种子品种及纯度的鉴定方法来源于遗传标记，目前在大麦品种鉴定工作应用较为广泛的遗传标记主要有形态标记、生化标记和DNA分子标记3种类型。

形态标记，即感官鉴定，是最常用的物种鉴定方法。利用种子的外部形态特征(如籽粒形状、颜色、麦芒等)来进行品种鉴定，如我国国标《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》(GB/T 3543.5-1995)对大麦种子品种的形态鉴定标记进行了规定；澳大利亚谷物贸易协会每年颁布的大麦品种标准中提供具体的标准样品图片及品种的形态鉴定特征。形态标记虽然简单、方便、直观，但在实际运用中，大麦品种繁多，不同品种间形态差异不明显，检验结果存在主观误差及准确性不高。

生化标记主要基于种子同工酶和贮藏蛋白如醇溶蛋白的电泳技术。同工酶电泳技术稳定性好、重复率高，但可利用的同工酶数量少、多态性低，该技术应用于大麦品种鉴定有其局限性。蛋白质电泳技术如醇溶蛋白-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)近年来被广泛运用于大麦品种鉴定，中国、欧洲啤酒协会(简称EBC)等将其列入标准方法；但该技术存在数据库不完整，检测时染色效果差，条带图像不容易判别等问题，而且对复杂的蛋白质样品及亲缘关系较近的品种，很难区分出来，逐渐体现出不适应市场的需求。

DNA分子标记是以生物大分子的多态性为基础而发展起来的一种遗传标记。DNA分子标记与形态标记和生化标记等相比，具有许多独特的优点：不受组织类别、发育阶段等影响，不受环境影响，标记数量多，具有较高的多态性等等。DNA分子标记技术发展至今已经几十种，被广泛应用于医学、生物、农学等众多领域，这些技术的发展与应用，为大麦品种及纯度鉴定工作提供了更多的研究手段。

2 DNA分子标记技术的分类

根据DNA分子标记的技术原理以及发展历史，DNA分子标记可被分为3类[3]：

(1)以southern杂交技术为核心，其中限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism，简称RFLP)为代表；该类技术的运用研究主要集中在上世纪八、九十年代。

(2)以PCR技术为核心，该类型的分子标记是从上世纪八十年代中期发展起来，其中，研究运用较为广泛的技术主要包括RAPD ( random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA) ，AFLP( amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR ( simple sequence repeat，简单重复序列)等等。

(3)以SNP ( single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)为基础的分子标记技术，为新型分子标记，是目前生物学研究的热点。SNP检测技术主要包括两大类，即基于凝胶电泳的SNP检测方法，如酶切扩增多态性序列(CAPS，又称PCR-RFLP)等；高通量的SNP检测方法，如测序、DNA芯片等。

3 DNA分子标记技术在大麦品种鉴定的应用

3.1RFLP标记技术

RFLP是1974年Grodzicker等发明，是最早发展起来的第一代分子标记方法。

RFLP的原理是利用特定的限制性内切酶酶切样品DNA，用特异性探针进行southern杂交，进而将与探针同源的酶切片段在长度上的多态性呈现出来。RFLP技术具有多态性稳定、重复性好等优点，该技术在上世纪八、九十年代多运用于物种的基因图谱绘制研究工作中。如首张大麦图谱是由Heun等4]在1991年利用procter×nudinka杂交F1代113个株系DH群体进行RFLP标记，并得到157个标记；Hintum等[5]利用RFLP分子标记系统构建了欧洲春季大麦的核心种质图谱并进行了比较。在大麦品种鉴定技术研究方面，RFLP相关的技术研究鲜有报道。

由于RFLP技术存在操作繁琐、灵敏度低、成本高、DNA用量大、试剂对人体有害等方面的劣势，该方法不适于进行大批量品种鉴定，在实际应用中受到限制。

3.2RAPD标记技术

RAPD是在 1990年由Williams和Welsh同时研发的检测技术，该技术的原理是以样品DNA为模板，利用随机引物进行PCR扩增，然后利用凝胶电泳检测DNA序列多态性。

RAPD技术具有操作简便、成本低、DNA 用量少等优点，被广泛用于品种及纯度鉴定、基因定位和基因克隆等多方面研究。国内外利用RAPD技术开展大麦品种鉴定的研究比较多，如：早在1998年Davila等[6]用RAPD技术对70份欧洲大麦和29份野生二棱大麦进行了分析，结果表明,这些品种可按生长习性和穗型分类；Hanif等[7]利用RAPD鉴定出10种来源不同的野生大麦；黄祥斌等[8]采用RAPD对北美的5种二棱啤酒大麦和11种六棱啤酒大麦进行了品种鉴定分析；吴亚君等[9]采用 RAPD-毛细管芯片电泳法对19 个啤酒大麦品系进行鉴定，区分得到13个组，包括8个单独的品系和5个品系组合。

但RAPD技术存在着不足：稳定性及重复性较差、易受各种因素的影响，另外，在用于二倍体作物研究时，不能有效区分纯合基因型和杂合基因型。该技术在广泛运用中也得到了不断的完善，如被转化为SCAR标记。

3.3AFLP标记技术

AFLP是1992年由Zzbeau和Vos发明的一项具有专利的分子标记技术，实质是 RFLP和 PCR技术的结合。其原理是对样品基因组DNA双酶切的产物经PCR扩增，然后将扩增后的限制性片段通过凝胶电泳技术检测DNA序列多态性。

AFLP具有多态性高、分辨率高等优势，AFLP技术在大麦品种鉴定研究中也有运用。谷方红等[10]采用AFLP技术，从20对引物中筛选出3对多态性较强的引物，结果表明，通过2～3对引物即可区分11个酿造型大麦品种；初雷[11]利用AFLP技术对27种国内外酿造大麦品种进行鉴定研究，筛选出3对带型清晰、多态性较高的引物组合。

但由于操作繁琐，对试验技能要求较高，试验周期较长，对DNA质量要求很高，AFLP技术难以在种子纯度鉴定中获得广泛应用[12]。

3.4SSR标记技术

SSR即简单序列重复，又称为微卫星 DNA(microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。SSR 标记技术的原理是根据SSR两侧的序列相对保守的特性，设计特异引物进行PCR扩增，根据串联重复单位数目的差异检测多态性。

SSR标记对 DNA需求量少，多态性高，结果稳定可靠，已在多种农作物的品种及纯度鉴定中得到应用。在大麦品种鉴定方面，如Russel等[13]仅用11个SSR标记就区分了包括相同系谱来源在内的24个大麦基因型，并利用4对SSR标记区分这24种大麦品种。杨振华[14]对35个啤酒大麦品种进行SSR扩增分析，扩增带清晰，具有多态性且稳定。近年来，SSR标记结合EST技术，在大麦品种鉴定研究中也得到了应用，如张利莎等[15]利用EST-SSR技术对4种大麦麦芽的纯度进行了鉴定，结果表明,EST-SSR标记能定性检测混杂度高于10%的麦芽样品。

SSR技术既有RFLP的稳定性和共显性的优点，又比 RAPD 标记成本低，技术简单。但是，SSR 标记技术也存在一些不足：新的引物开发成本高且有一定的难度，同时 SSR 标记检测所用标记数是影响鉴定效率和成本的一个关键因素。

3.5SNP分子标记技术

1996 年， Lander首次提出 SNP标记技术，是第三代分子标记。SNP 是指由单个核苷酸的变异而导致的 DNA 序列多态性。目前，针对SNP标记的检测手段主要有：CAPS(酶切扩增多态性序列)、AS-PCR(等位基因特异性PCR)、KASP(竞争性等位基因特异性PCR)、测序、质谱检测法、HRM(高分辨率溶解曲线)。

SNP 标记具有数量丰富、稳定性好、高通量和高度自动化等优点。目前，利用SNP标记在大麦品种鉴定的研究已有相关报道。Pattemore等[16]运用基于MALDI-TOF质谱分析的SNP检测方法，能高效区分澳大利亚的大麦品种；张利莎等[15]利用基于KASP技术的SNP标记对大麦麦芽的纯度进行了检测，结果表明，SNP标记能够有效鉴定混杂度低至5%的麦芽样品；徐东东[17]等也利用基于KASP技术的SNP标记对大麦麦芽的纯度进行了检测，并同时结合品质分析，结果表明，两种方法的联合分析，能快速确定麦芽的真实性和纯度。

SNP标记在筛选有效的SNP以及结果数据分析等方面还存在困难，但随着SNP分子标记检测技术的应用和完善，其在品种鉴定研究中将发挥更大的作用。

4 展望

DNA分子标记技术因其快速、准确、稳定、不受环境因素影响等特点，为物种鉴定提供了一种更为有效和可靠的方法。啤酒大麦品种的真实性及纯度的鉴定工作无论在贸易或生产上，都是很关键和基础环节。利用DNA分子标记技术，不断完善啤酒大麦品种鉴定技术体系，并且能使该技术体系标准化，广泛运用到实际贸易和生产中，对于保障啤酒大麦的质量具有重要意义。

[1] 刘 慧，薛凤蕊.中国大麦贸易现状及发展趋势[J].农业贸易展望，2015,11(8):66-69.

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[10] 谷方红，张五九，冯景章，等. 酿造大麦品种鉴定技术的研究[J].啤酒科技， 2003 (11)：27-29.

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(责任编辑：赵琳琳)

降低农作物镉超标概率途径被发现

日前，中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室陈卫平研究组在农作物镉污染研究方面取得新进展。研究结果近日发表在美国化学学会旗下的《农业与食品化学》期刊上。

农作物镉污染是当前国内外关注的主要问题之一，定量化各环境因子对农作物镉累积的影响程度对区域镉污染风险调控至关重要。目前实验室规模的影响因子解析和调控手段难以指导实际应用。

陈卫平研究组从“土壤-土壤溶液-作物吸收”概念出发，通过对湖南攸县蔬菜和水稻镉富集水平的长期观测，揭示了镉固液分配系数(Kd)和农作物镉富集因子(PUF)变化特征及其主要影响因子，并结合大田实验和模型模拟进行验证和风险评估。研究发现，改善土壤酸化和恢复土壤微量元素平衡可显著降低区域农作物镉超标概率。该研究为我国农作物镉污染现状改善和风险管理提供了科学方法和理论依据。

(摘自ZGSPAQB,2017-07-18)

DNAmolecularmarkeranditsapplicationinidentificationofseedvarietiesofbeerbarley

CHEN Ping，LI Pan-pan，MAI Li-shan，LI Jiao-jiao， HE Cui-xia，ZHAO Shu-jia,WU Xiao-yao，CHEN Ying

(Nansha Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau Comprehensive Technical Service Center，Guangzhou 511400,China)

We briefly analyzed the commonly used methods in the identification of barley seed varieties, then reviewed the principles,advantages and disadvantages and research status of several commonly used molecular marker technologies in the variety and the purity identification of barely, in order to provide references for the DNA molecular marker research in this field.

DNA molecular marker；beer barley；identification of seed varieties

2017-03-15；

2017-07-20

广东检验检疫局科技计划项目(2016GDK41)。

陈 萍(1978-),女，高级农艺师，研究方向为品质检验。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.08.015

S503.3;S512.3+1

：A

：1003-6202(2017)08-0063-04