初治肺结核患者维生素D与其受体基因多态性位点FokI的相关性分析

金武 杜荣辉 曹探赜

初治肺结核患者维生素D与其受体基因多态性位点FokI的相关性分析

金武 杜荣辉 曹探赜

目的 分析初治肺结核患者血清维生素D(VD)与维生素D受体(VDR)基因多态性位点FokI的相关性。方法 对我院随机选取的180位初治肺结核患者和100位正常对照的血清VD水平，VDR基因多态性位点FokI基因型进行检测，比较和分析2组血清VD水平与VDR基因FokI多态性差异以及相关性。结果 初治肺结核患者血清VD水平明显低于正常对照组(P<0.0001)；初治肺结核组VD营养缺乏率(70.5%)明显高于正常对照组(47.0%)，VDR基因多态性位点FokI的三种基因型(纯合子FF，纯合子ff和杂合子Ff)在两组内的分布差异具有统计学意义(P=0.033)，初治肺结核组纯合子ff及等位基因f比率明显高于正常对照组(P<0.05)；初治肺结核患者基因型ff组VD水平明显低于基因型FF组和基因型Ff组(P<0.05)。结论 初治肺结核患者血清VD水平明显下降，VDR 基因多态性位点FokI基因型ff为肺结核易感基因。

初治肺结核；维生素D；维生素D 受体；FokI；基因多态性

肺结核是目前全世界重要的公共卫生问题。越来越多研究显示维生素D(VD)在肺结核防治方面有一定作用。研究表明，VD 的活化代谢产物1,25-二羟维生素D3 (1,25-(OH)2-D3)可诱导并增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的杀菌功能。VD的缺乏与结核易感性存在相关性[1]。维生素D受体(VDR)是由染色体12q上的VDR基因编码，该基因具有多种单核苷酸多态性，且VDR基因多态性也与活动性肺结核易感性有关[2]。但是VD与VDR基因多态性位点的关系还不明确。本实验通过对初治肺结核患者血清VD水平和VDR基因多态性位点FokI的检测，拟明确初治肺结核患者血清VD水平与VDR基因多态性位点FokI的相关性。

资料与方法

一、研究对象

随机选取2015年4月至2016年10月期间在我院就诊的初治肺结核患者(180例)，以及同一时期在我院体检的正常对照(100例)作为研究对象。依据肺结核诊断和治疗指南[3]诊断初治肺结核。排除标准：合并患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、肝脏疾病、肾功能衰竭、肾结石、恶性肿瘤、糖尿病、怀孕、甲状旁腺功能亢进；服用任何糖皮质激素、免疫抑制剂、噻嗪类利尿剂、钙补充剂、VD等。所有研究对象均签署知情同意书，所有实验均符合本院伦理委员会规定。

二、研究方法

1 血清VD的检测：两组均于清晨空腹留取外周静脉血5mL，其中3mL用于制备血清，-70℃冰箱冻存备检。另外2mL提取全基因组DNA，-20℃冰箱冻存备检。VD采用放射免疫法(radiate immuno assay, RIA)检测，使用25-(OH)D3放射免疫试剂盒(DiaSorin, USA)对血清样本进行检测。所有的检测步骤均严格按说明书进行。

2 VDR 基因FokI多态性检测：采用苯酚/氯仿提取法提取全血基因组DNA。根据 Genebank 中 VDR 基因的序列，由上海英骏生物技术有限公司合成含FokI多态位点的引物[4]，即正义链5’-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3’，反义链5’- ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3’。采用PCR试剂盒(Beyotime, China)扩增VDR基因目的片段，然后用限制性内切酶FokI(New England Biolabs)对PCR扩增产物在37℃下酶切反应4小时。限制性酶切片段在2.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，并在紫外凝胶成像系统中拍照保存。根据酶切模式，基因型分为：纯合子FF，产物大小为265bp；纯合子ff，产物大小为169bp和96bp；杂合子Ff，产物大小分别为265bp，169bp和96bp。

三、统计学处理

结 果

一、血清VD的检测结果

对初治肺结核(PTB)和正常对照组(Con.)的基本特征及血清25-(OH)D3的检测发现，初治肺结核患者的平均体质量指数 (body mass index，BMI)，25-(OH)D3水平明显低于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.0001)。两组在年龄和性别的差异无统计学意义，P>0.05。(见表1)。

表1 研究对象的基本特征±s)

二、VD营养水平差异

为更清楚地观察VD营养水平在初治肺结核和正常对照组中的分布特征，我们按VD缺乏(<20 ng/mL)、不足(20-30 ng/mL)、充足(>30 ng/mL)进行分层比较[5]。PTB组VD营养缺乏率达70.5%，高于正常对照组的47.0%。PTB组VD水平充足的比例仅12.8%，低于正常对照组的22.0%。2组之间差异具有统计学意义(χ2=15.202,P=0.0005)。(见表2)。

表2 初治肺结核患者血清VD营养水平差异(n%)

三、VDR基因FokI多态性变化

根据FokI 多态性位点的差异，VDR的基因型分为：纯合子FF，酶切产物大小为265bp；纯合子ff，酶切产物大小为169bp和96bp；杂合子Ff，酶切产物大小分别为265bp，169bp和96bp，(见图1)。在肺结核组和正常对照组内均检测到这三种基因型。其中，PTB患者VDR基因FF基因型比率(28.3%)低于正常对照组(42.0%)，ff基因型比率(13.9%)高于正常对照组(7.0%)，差异具有统计学意义 (χ2=6.818,P=0.033)。PTB患者VDR基因等位基因F比率(57.2%)低于正常对照组(67.5%)，等位基因f比率(42.8%)高于正常对照组(32.5%)，差异具有统计学意义 (χ2=5.703,P=0.017)。(见表3)。

图1 限制性内切酶检测VDR基因FokI 多态性位点。纯合子FF 无 FokI酶切位点，酶切电泳后只有一个条带(265bp，Line2，6和7)；纯合子ff含有FokI酶切位点，酶切电泳后有两个条带(169bp和96bp，Line4，8和9)；杂合子Ff含有FokI酶切位点，酶切电泳后有3个条带(265bp，169bp和96bp，Line3，5和10)。M=Marker，Line1为非酶切PCR产物(265bp)。

表3 初治肺结核患者与正常对照组VDR基因FokI多态性比较(例%)

四、VDR基因FokI多态性与VD的关系

通过分析初治肺结核患者VDR基因多态性位点FokI三种基因型与VD的关系发现，纯合子ff组25-(OH)D3水平明显低于纯合子FF组和杂合子Ff组，差异具有统计学意义(P<0.05)。纯合子FF组和杂合子Ff组25-(OH)D3水平差异无统计学意义。(见表4)。

表4 初治肺结核患者及正常对照组FokI多态性与VD的关系

讨 论

维生素D调整人体钙磷代谢平衡的作用已得到广泛认同。随着对 VD 的进一步研究发现，它还有免疫调节功能，减少呼吸消化系统的感染性疾病发病率[6]。VD 的免疫调节作用是多方面的[7]，一方面，VD可促进单核细胞向巨噬细胞转化，当结核分枝杆菌感染人体后，巨噬细胞分泌大量多种细胞因子，进而刺激 T 淋巴细胞活化，分泌包括 IFN-γ在内的很多细胞因子，以尽快启动抗结核免疫反应；另一方面，VD 可通过抑制抗原呈递细胞的成熟，防止抗原呈递细胞过度刺激 T 淋巴细胞，调节 T 淋巴细胞的适度反应，抑制 TNF-α过量产生的免疫病理损伤。

维生素D有3种代谢产物：1, 25-(OH)2-D3，1,24,25-(OH)3-D3，25-(OH)D3。其中以25-(OH)D3在血液中浓度最高，最稳定，且半衰期最长，又是合成1, 25-(OH)2-D3的前体。因此，它是反映体内维生素D的最佳指标[5,8]。VDR是维生素D生物活性形式1, 25-(OH)2-D3发生作用的主要受体。VDR基因于1988年被克隆出来，其位于人12号染色体长臂上，包括9个编码的外显子和8个内含子，共编码427个氨基酸，5’端非编码区包括1A、1B、1C外显子，2-9号外显子编码基因的蛋白产物。VDR基因具有高度多态性，目前报道有22个点突变均可导致基因功能缺失，已经证实基因多态性与多种疾病相关，如多发性硬化、类风湿关节炎、乳腺癌、糖尿病、恶性黑色素瘤、银屑病、骨质疏松等[9]。VDR基因有4个常见的单核苷酸多态性位点，分别是FokI、BsmI、ApaI和TaqI。多态性位点FokI位于VDR基因第2外显子的起始密码子上，是唯一能影响编码氨基酸的多态位点，目前很多实验证明该位点是由于427ATG→ACG突变导致，其多态性的存在使VDR基因第2外显子上有两个潜在的起始转录点，即使VDR翻译从第2个密码子开始，从而导致翻译出的蛋白质比正常VDR基因编码少了3个氨基酸(aa)，为424个aa，但424aa的转录活性大大增强[10-11]

本实验在初治肺结核组和正常对照组内均检测到VDR基因多态性位点FokI三种基因型FF，Ff，ff。在VDR 基因多态性中，FF 型(42.0%)及 Ff 型(51.0%)在普通人群中所占的比例较高，而 ff基因型(7.0%)所占人群比例偏低，但相比较初治肺结核的患病人群中，携带ff 基因型(13.9%)的患者远高于普通人群携带ff基因的比例，因此很多科研人员认为ff型基因为结核易感基因。通过分子生物学方面的研究还发现，VDR 基因 FokI 位点中ff基因型影响 VDR 活性，致使 VDR 与 VD 形成复合体发挥抗结核的功能受到了不利影响[12-13]。

VD 在人体内发挥作用是通过保持其适宜范围的浓度，保证 VDR 有足够的启动因子来实现的。而 VDR 在细胞核上的表达数量、构象结构、与 VD 的结合能力、形成复合物后启动下一步反应的能力也最终决定了其发挥相应生物学作用的能力[14-15]。本研究发现，FokI三种基因型在 VD 浓度方面表现出FF组和Ff组明显高于ff组，FF组和Ff组之间差异无统计学差异。由此可见，VDR 基因FokI多态性与 VD 浓度以及结核的易感性有关，ff基因型患者VD合成不足，且更易患肺结核。

总之，初治肺结核组患者血清维生素D水平明显下降，且VDR基因FokI多态性发生变化。VDR 基因多态性与血清VD水平和肺结核易感性有相关性，ff基因型人群可能需要预防低VD血症及肺结核可能。

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Association of vitamin D with its receptor genetic polymorphism site FokI in newly diagnosed pulmonary tuberculosis

JINWu,DURong-hui,CAOTan-zhen

theThirdWardsofInternalMedicine,WuhanPulmonaryHospital,Wuhan,Hubei430030,China

Objective To analyze the correlation between vitamin D (VD) and vitamin D receptor (VDR) genetic polymorphism site FokI in newly diagnosed pulmonary tuberculosis patients. Methods 180 newly diagnosed pulmonary tuberculosis patients (PTB) and 100 healthy control were randomly selected. Their serum VD levels and VDR genetic polymorphism site FokI were detected and compared. Results Serum VD level was significantly lower in the PTB group than in the control group (P<0.0001). The deficiency of VD was significantly higher in the PTB group (70.5%) than in the control group (47.0%). The difference of the three genotypes (homozygous FF, homozygous ff and heterozygous Ff) of VDR polymorphism site FokI in the two groups was statistically significant (P=0.033). The rate of homozygous ff and allele f in the PTB group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The level of VD in the ff group was significantly lower than in the FF group and the Ff group in PTB (P<0.05). Conclusion The level of serum VD decreases significantly in newly diagnosed PTB. VDR genetic polymorphism site FokI genotype ff is the susceptibility gene of PTB.

newly diagnosed pulmonary tuberculosis; vitamin D; vitamin D receptor; FokI; genetic polymorphism

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.09.031

430030 湖北 武汉，武汉市肺科医院内三病区

2017-01-14]