Graves甲亢和Graves突眼治疗前后TBX21、GATA3、RORC、FOXP3 mRNA表达水平的变化

陈谱，王悦，施秉银

(西安交通大学第一附属医院内分泌科，陕西西安710061)

Graves甲亢和Graves突眼治疗前后TBX21、GATA3、RORC、FOXP3 mRNA表达水平的变化

陈谱，王悦，施秉银

(西安交通大学第一附属医院内分泌科，陕西西安710061)

目的探讨Graves甲亢和Graves眼病患者不同治疗方法治疗前后外周血单个核细胞中Th1、Th2、Th17、Treg细胞转录因子TBX21、GATA3、RORC、FOXP3 mRNA表达水平的变化及其意义。方法选择2014年9月至2016年5月就诊于西安交通大学第一附属医院内分泌门诊的新发未治的Graves甲亢患者12例，给予甲硫咪唑治疗(MMI)；Graves眼病患者12例给予甲强龙冲击治疗(IVMP)，采集患者治疗前后外周血，提取外周血单个核细胞RNA，通过实时荧光定量PCR检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞转录因子(TBX21、GATA3、RORC及FOXP3)mRNA的表达情况。结果Graves甲亢病组治疗缓解后与治疗前比较，RORC[(0.090 2±0.036 4)vs(0.292 6±0.198 6)]和FOXP3[(0.088 9±0.058 7)vs(0.148 6±0.072 6)]的表达均明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；Graves眼病组治疗前后相比TBX21[(0.043 7±0.026 0)vs(0.043 6±0.019 6)]、GATA3[(0.040 5±0.023 3)vs(0.043 7±0.015 8)]、RORC[(0.184 4±0.094 9)vs(0.174 5±0.066 5)]及FOXP3[(0.1324±0.075 7)vs(0.187 0±0.059 5)]差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗前Graves眼病组与Graves病组比较RORC[(0.184 4±0.094 9)vs(0.090 2±0.036 4)]的表达显著高，且差异有统计学意义(P＜0.01)。结论MMI和IVMP治疗会影响T细胞的分化；各T细胞亚群转录因子mRNA表达水平的变化与疾病的发展和治疗结果密切相关。

Graves甲亢；Graves眼病；TBX21；GATA3；RORC；FOXP3

Graves病是一种器官特异性自身免疫性疾病，临床以弥漫性甲状腺肿大，甲状腺毒症为特征。Graves眼病患者可伴有或不伴有甲状腺功能亢进症，Graves眼病可出现在甲亢前或在甲亢经过药物、手术、放射性碘等治疗后发生[1]，但大约有80%的患者Graves眼病与Graves病几乎同时发生[2]。Graves甲亢的治疗是一个漫长的过程，且容易复发，复发率达40%[3]或甚至能达到50%～60%[4]。对于发病机制，有研究证明T淋巴细胞致敏甲状腺素受体，合成针对这些抗原的甲状腺素受体抗体，T细胞在疾病的发生发展中起重要作用，抗原特异性T淋巴细胞接受自身抗原TSHR的刺激后分化为不同的T淋巴细胞亚群，行使不同的功能。本研究通过检测治疗前后患者外周单个核细胞中各T细胞亚群的转录因子的表达，旨在探讨Graves甲亢及Graves眼病治疗前后Th1、Th2、Tth17和Treg的变化及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2014年9月至2016年5月就诊于西安交通大学第一附属医院内分泌门诊的患者，根据临床表现和血清游离三碘甲腺原氨酸(FT3)升高、血清游离甲状腺素(FT4)升高、促甲状腺激素(TSH)降低、促甲状腺素受体抗体(TRAb)增高收集初发未治的Graves甲亢患者，给予此患者起始量为30 mg/d的甲硫咪唑(MMI)[5]，定期根据临床表现及甲状腺功能水平调整药物剂量。将经上述规律治疗且停药后3个月甲功仍处于正常的患者(12例)纳入本研究，并按其治疗前后分为Graves甲亢治疗前组和Graves甲亢治疗后组；根据国际NOSPECT标准及CAS活动状态评估，选择NOSPECT四级且活动度CAS≥3分的患者[6]，给予静滴9 g为一个疗程的甲基强的松龙(IVMP)和起始量30 mg/d的甲硫咪唑(MMI)，将规律治疗后眶部症状得以缓解的患者(12例)纳入研究，并按其治疗前后分为Graves眼病治疗前组及Graves眼病治疗后组。Graves甲亢组及Graves眼病组，治疗后未得到缓解的患者不计入实验组中。所有入选对象年龄(40±13)岁，均排除近期有感染史、妊娠、合并其他免疫性疾病史。两组性别、年龄等差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法分别在治疗前和治疗缓解后于清晨空腹采集入组患者静脉血3 mL，用淋巴分离液分离血液中单个核细胞后，用trizol提取RNA。严格按照反转录试剂盒说明书反转cDNA，进行实时定量PCR检测TBX21、GATA3、RORC、FOXP3及内参18S的表达。

1.3 统计学方法应用SPSS16.0软件进行分析，年龄、FT4以及TBX21、GATA3、RORC、FOXP3定量结果以均数±标准差(x-±s)表示，组内比较进行配对t检验；组间比较采用独立样本t检验；性别比较进行χ2检验，均P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料两组患者临床资料及治疗前后FT4的结果显示给予治疗后，Graves甲亢及Graves突眼两种疾病的患者甲功均转为正常，见表1。

2.2 两组患者T细胞亚型转录因子的表达变化Graves突眼治疗前与治疗缓解后TBX21和GAGT3差异无统计学意义(P＞0.05)，RORC在治疗缓解后表达低于治疗前，而FOXP3在治疗缓解后表达高于治疗前，但差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2和图1A。Graves甲亢治疗缓解后TBX21、GAGT3、RORC及FOXP3四种转录因子均高于治疗前，且RORC和FOXP3差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2和图1B。Graves突眼治疗前各T细胞亚型转录因子的表达均高于Graves甲亢治疗前，同时Th17细胞的转录因子RORC的表达差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2和图1C。

表1 两组患者临床资料比较

表2 Graves甲亢及突眼治疗前后T细胞转录调节因子的表达

表2 Graves甲亢及突眼治疗前后T细胞转录调节因子的表达

注：Graves甲亢治疗后组与治疗前组比较，aP＜0.05；治疗前Graves病组与Graves突眼组比较，bP＜0.01；Graves突眼治疗前与Graves甲亢治疗前TBX21比较(t=1.607，P=0.127)，GAGT3(t=1.654，P=0.112)，RORC(t=3.211，P=0.006)，FOXP3(t=1.791，P=0.087)。

组别Graves突眼FOXP3 0.132 4±0.075 7 0.187 0±0.059 5 -1.693 0.119 0.088 9±0.058 7 0.148 6±0.072 6a-2.385 0.036时间治疗前治疗后例数12 12 t值P值Graves甲亢治疗前治疗后12 12 t/值P值TBX21 0.043 7±0.026 0 0.043 6±0.019 6 0.009 0.993 0.030 0±0.013 6 0.047 9±0.036 8 -1.481 0.167 GAGT3 0.040 5±0.023 3 0.0437±0.015 8 -0.375 0.715 0.026 5±0.017 7 0.045 1±0.026 3 -1.848 0.092 RORC 0.184 4±0.094 9 0.174 5±0.066 5 0.344 0.737 0.090 2±0.036 4b0.292 6±0.198 6a-3.100 0.010

图1 Graves甲亢及突眼治疗前后T细胞转录调节因子的表达

3 讨论

机体在正常情况下T淋巴细胞的各个亚群相互作用，维持着机体的正常免疫功能。当淋巴细胞亚群中各细胞数量、比例或功能发生异常时，就有可能导致机体免疫功能发生紊乱并出现病理变化。CD4+T细胞主要分化为辅助性T细胞(Th1、Th2、Th17)和调节性T细胞(Treg)[7]。目前很多血清学或细胞水平的研究表明，T淋巴细胞亚群在自身免疫性疾病中都有异常改变。

Graves病是由促甲状腺素受体抗体引起的一种自身免疫性疾病，目前有很多关于其发病及治疗后缓解机制的研究，Th1、Th2、Th17及Treg的免疫水平成为近年的研究热点。计学理等[8]、谢建平等[9]、李学军等[10]曾研究了Graves病不同治疗方法治疗前后患者外周血细胞因子的变化，其结果显示Th1和Th2细胞在外周血中的比例各研究不尽相同，而本实验从转录因子的mRNA水平研究显示初发未治的Graves甲亢病及Graves眼病患者的Th1和Th2细胞水平在治疗前与治疗缓解后均没有明显的变化。本实验在Th17转录因子mRNA水平的结果为Graves病治疗缓解后高于治疗前，在Graves眼病治疗前后Th17转录因子mRNA水平没有明显变化。然而，Th17细胞作为炎症介导细胞，治疗后外周Th17细胞应降低，炎症反应减轻，疾病得以缓解，其转录因子mRNA水平却高于治疗前，这可能与疾病过程中的转录生成有关，虽然转录因子mRNA水平高，但其生成Th17数目却没增或破坏过多导致外周Th17细胞降低。综合以上实验我们可以看到，虽然在Graves甲亢病及Graves眼病患者治疗前后Th1、Th2和Th17细胞会有细胞、细胞因子及转录调控因子水平的变化，但是目前的研究结果也不大一致，因此我们暂且可能无法通过Th1、Th2和Th17细胞相关因素对疾病的发展与缓解做出明确的判断，因此我们需更多的实验进一步的探讨这三种T细胞亚型与疾病是否存在一定的关联。

杨静等[11]关于调节性T细胞的研究结果为Graves病碘131及抗甲状腺药物治疗后Treg在外周血中的比例较治疗前均升高；查兵兵等[12]研究了Graves病碘131治疗一个月后的外周血Treg细胞及Foxp3 mRNA表达水平的变化，其结果显示两者在治疗后均有增加，但差异无统计学意义；我们的研究结果为Treg细胞转录因子Foxp3 mRNA表达水平在Graves病治疗缓解后有所增加，但在Graves突眼治疗前后变化差异无统计学意义。以上研究结果均显示，调节性T细胞及其转录调控因子的mRNA表达水平会在Graves甲亢治疗缓解后有明显增多，但在Graves突眼中就无此改变。这就提示我们Treg细胞的变化可能与Graves病的发展有一定的相关性。

综上所述，Graves病的发病机制复杂，不同时期T细胞亚群的比例不同，Graves甲亢和Graves突眼虽然都会存在甲状腺激素较高，但在发病机制方面有很大的不同。通过本实验以及和其他众多研究的对比与总结发现，目前Th1、Th2和Th17细胞或转录因子的mRNA表达水平在Graves病治疗中的特征性趋势不明显，然而调节性T细胞和其转录因子的mRNA表达水平的变化趋势随着疾病的缓解明显增多，这就意味着或许调节性T细胞及其转录因子的mRNA表达水平可以作为后续观察Graves甲亢治疗缓解的一个新思路。

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[12]查兵兵,刘军,查英,等.Graves病患者(131)I治疗前后CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞的变化[J].中国免疫学杂志,2012,28(11): 1032-1035.

Changes of the mRNA expression of TBX21,GATA3,RORC,FOXP3 before and after the treatment of Graves' hyperthyroidism and Graves'ophthalmopathy.

CHEN Pu,WANG Yue,SHI Bing-yin.Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the mRNA expression of Th1,Th2,Th17 and Treg transcription factors (TBX21,GATA3,RORC and FOXP3)in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of patients with Graves′hyperthyroidism and Graves′ophthalmopathy treated by methimazole(MMI)and methylprednisolone pulse therapy(IVMP), respectively.MethodsA total of 12 patients with early-onset Graves′hyperthyroidism and 12 patients with Graves′ophthalmopathy,who admitted to Department of Endocrinology of the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University from September 2014 to May 2016,were respectively treated with MMI and IVMP.PBMCs were obtained before and after different the treatment,and the RNAs of PBMCs were extracted.qRT-PCR was used to analyze the mRNA expression levels of Th1,Th2,Th17 and Treg transcription factors(TBX21,GATA3,RORC and FOXP3).ResultsThe mRNA level of RORC and FOXP3 of Graves′hyperthyroidism group before the treatment of MMI were respectively (0.090 2±0.036 4)and(0.088 9±0.058 7),which were significantly lower than(0.292 6±0.198 6)and(0.148 6±0.072 6) after the treatment(P＜0.05).Moreover,there was no significantly differences in the expression of TBX21(0.0437± 0.0260)vs(0.043 6±0.019 6),GATA3(0.040 5±0.023 3)vs(0.043 7±0.015 8),RORC(0.184 4±0.094 9)vs(0.174 5± 0.066 5)and FOXP3(0.132 4±0.075 7)vs(0.187 0±0.059 5)in Graves′ophthalmopathy patients before and after the treatment of IVMP.However,the expression of RORC(0.184 4±0.094 9)vs(0.090 2±0.0364)in Graves′ophthalmopathy group was significantly higher than that in Graves′hyperthyroidism group(P＜0.01).ConclusionMMI and IVMP treatment have effect on the differentiation of T cells.The changes in the mRNA expression of the transcription factors of each T cell subset are closely related to the development of the disease and the outcome of the treatment.

Graves′hyperthyroidism;Graves′ophthalmopathy;TBX21;GATA3;RORC;FOXP3

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.008

R582+.1

A

1003—6350（2017）15—2437—04

2017-01-06)

国家自然科学基金(编号：81670725)

施秉银。E-mail：shibingy@126.com