贵州两市猪源大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶的检测

杜安定，谭艾娟＊ ，陈 婷，李悦欣，王珍燕，杜国琴

(贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

贵州两市猪源大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶的检测

杜安定，谭艾娟＊ ，陈 婷，李悦欣，王珍燕，杜国琴

(贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

为了解贵州安顺、遵义市猪源细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性，采用CLSI 推荐的双纸片扩散法，调查108株临床分离的大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌的比例。结果表明：遵义、安顺两市108株大肠杆菌确认有72株ESBLs 阳性菌株，检出率66.7%(72/108)，其中遵义市（79.6%，43/54）检出率高于安顺市（53.7%，29/54），两市猪源产ESBLs大肠杆菌的检测率较高，对β-内酰胺类抗生素的耐药较为严重。

耐药性；β-内酰胺类抗生素；产ESBLs大肠杆菌

β-内酰胺类抗生素毒副作用小，抗菌活性强，抗菌谱广，是人医临床上和兽医临床最常用的抗生素，随着此类药物的广泛应用，导致细菌的耐药性增强，同时也造成畜产品中的抗生素药物残留增加，危害了养殖业的健康发展[1-3]。细菌产生β-内酰胺酶降解此类抗生素是其耐药的主要机制，超广谱β-内酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases ESBLs）主要由大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌等G-菌产生，可水解灭活青霉素类、头孢菌素类和单环β-内酰胺类抗生素，可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，细菌产生ESBLs后可对多种β-内酰胺酶类抗生素耐药[4]，因此，可通过调查区域内ESBLs菌株的比例来评价该区域内细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药水平[5]。本研究对贵州省遵义、安顺两市猪源大肠杆菌产ESBLs菌株的比例进行了调查，以期对两市β-内酰胺类抗生素的正确选用和降低细菌耐药性危害提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

实验菌株：已鉴定的108株猪源大肠杆菌分别采自贵州遵义和安顺地区。

质控菌株：大肠埃希氏菌质控菌株ATCC 25922，购自中国兽药监察所。

表1 药敏纸片

1.1.2 培养基

LB肉汤：用于活化细菌。米勒-海顿琼脂（MHA）：规格250 g/瓶，批号111226，购自上海博微生物科技有限公司。

1.1.3 药物

药敏纸片：见表1。

1.2 方法

产β-内酰胺酶细菌筛选：按CLSI 推荐的纸片扩散法进行操作和结果判读[6-7]。一般情况抑菌圈＜ 10 mm为低敏， 10 mm＜抑菌圈＜ 15 mm为中敏，15 mm＜抑菌圈＜ 20 mm为高敏，抑菌圈＞ 20 mm为极敏，无抑菌圈为不敏感[7]。

初筛实验：将受试菌株均匀涂布于M-H琼脂平板，贴头孢他啶（30 µg/片)和头孢噻肟（30 µg/片)，37 ℃培养16～18 h。当两个药物抑菌圈直径满足以下任一条件：即头孢他啶 ≤ 22 mm，头孢噻肟 ≤ 27 mm，判定为疑产β-内酰胺酶菌株，需进一步作确证试验。以大肠埃希菌ATCC 25922作阴性对照，同时以肺炎克雷伯菌ATCC700603作阳性对照。

确证实验：将受试菌株均匀涂布于M-H 琼脂平板，分别贴头孢他啶（30 µg/ mL)、头孢他啶/克拉维酸（30/10 µg/片）以及头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸（30/10 µg/片）2 组纸片，37 ℃培养16～18 h，细菌对两个中任何一个药物加克拉维酸后抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值 ≥ 5 mm时，判定为产β-内酰胺酶菌株。

2 结果

2.1 产β-内酰胺酶细菌判定

如图1所示，头孢他啶抑菌圈 ≤ 22 mm，头孢噻肟抑菌圈 ≤ 27 mm；同时，头孢噻肟/克拉维酸抑菌圈 －头孢噻肟抑菌圈 ≥ 5 mm，头孢他啶/克拉维酸抑菌圈－头孢他啶抑菌圈 ≥ 5 mm，因此，判定该菌为产β-内酰胺酶菌株。

2.2 遵义、安顺两市产ESBLs大肠杆菌检测结果

108株大肠杆菌经初筛和确证试验，有72株ESBLs阳性菌株，检出率66．7%，72/108，其中遵义市检出率（79．6%，43/54）远高于安顺市的（53．7%，29/54），详见表2。

表2 108株大肠杆菌ESBLs菌检测结果

图1 产ESBLs大肠杆菌双纸片筛选结果

3 讨论

从青霉素应用于细菌感染的治疗后近100年来，抗菌药物有效降低了人和动物的细菌感染性疾病的危害，给人类健康和生活水平的改善带来巨大的福音。随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药水平不断升高，使临床治疗失败的风险不断加大，对人类健康和养殖业的健康发展构成严重威胁。β-内酰胺类药物高效、低毒、广谱，是临床最重要的抗生素，其包括青霉素类、头孢菌素类和非典型β-内酰胺类抗生素等。细菌可通过产生降解药物的β-内酰胺酶、改变靶点对药物的亲和力、降低本身细胞膜的通透性、增强主动外排等方式获得对β-内酰胺类抗生素的耐药[8]；而产生β-内酰胺酶是细菌获得高度耐药的主要方式，而ESBLs由质粒介导，其可在不同细菌间广泛传播，产生对多种β-内酰胺类抗生素的耐药，在耐药基因水平传播中发挥重要作用。

2005-2012年中国细菌耐药监测（CH INET）结果显示大肠杆菌中产ESBLs菌株的检出率高[9]，并呈逐年增加的趋势上升，直至2012年的检出率高达55．3%。估计2012年至今，其结果一直处于上升趋势[10]；本研究显示也符合上述推断。遵义市、安顺市猪源产ESBLs的大肠杆菌检出率分别为79．6%和53．7%，明显高于赵凤菊[11]等报道的辽宁地区猪源大肠埃希菌产ESBLs 30．77%的检出率。说明β-内酰胺类抗生素在该两市的猪场中的使用率高于国内部分地区。

建议两市应减少β-内酰胺类抗生素在猪场的使用，以恢复细菌对此类药物的敏感性。

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2017-06-19)

贵阳市农委科学技术计划项目（贵阳市屠宰场猪肉致病菌污染调查及防控措施研究［ 筑科合（2010）12 -11］）

杜安定（1992-） , 男, 贵州湄潭人， 硕士研究生， 研究方向：生物化学与分子生物学

谭艾娟（1963-）， 女， 教授， 从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：ajtan@gzu.edu.cn