MR molecular probes RGD-USPIO in evaluation effect of ucleoside combination on human hepatoma cell line Bel-7402 in vitro

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(1.Imaging Center, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang 261031, China; 2.Department of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

MR molecular probes RGD-USPIO in evaluation effect of ucleoside combination on human hepatoma cell line Bel-7402 in vitro

ZHAORongrong1,HANMing2,CHENGXin1,ZHANGShizhuang1*

(1.ImagingCenter,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261031,China; 2.DepartmentofClinicalMedicine,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

Objective To evaluate the effect and the anti-tumor mechanism of nucleoside combination on human hepatoma cell line Bel-7402 with Arg-Gly-Asp sequence labeled by ultrasmall superparamagnetic iron oxide (RGD-USPIO). Methods The tumor cells Bel-7402 of logarithmic phlyhase were divided into experimental group and control group, treated with 1 mmol/L nucleoside combination and 1640 medium respectively. The two group were co-cultured for 48 h, and were added RGD-USPIO and co-cultured for 6 h. Then the two groups were proceeded with MR scanning, and the signal intensity of T2WI were measured. After extraction of the total RNA and protein of experiment group and control group, the expression of integrin ανβ3was detected using real-time PCR and Western blot. Results The T2WI signal intensity of experimental group (997.35±42.83) was higher than that of control group (241.05±15.36,t=28.79,P<0.01). Compared with control group, the expression of integrin ανβ3mRNA in experimental group was (0.22±0.02) times (t=4.50,P<0.01). According to Western blot, the protein bands of experimental group were relatively lighter than that of control group, the expression of integrin ανβ3in experimental group was lower (t=11.88,P<0.01). Conclusion Nucleoside combination has anti-tumor effect by inhibiting integrin ligand-receptor binding, and the anti-tumor mechanism may be related to the induction of tumor cell apoptosis. MR molecular probes can conveniently and accurately evaluate the anti-tumor effect of nucleoside combination on Bel-7402 cells.

Arg-Gly-Asp; Ultrasmall superparamagnetic iron oxide; Ucleoside combination; Integrin ανβ3

表1 引物序列及产物大小

分子影像技术以其可活体研究、可重复、无创伤等特点，在研究药效学的过程中可减少研究时间、节约研究材料并缩减研究花费等[1]。本课题组前期已成功制备超微超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)标记的含有精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列的环肽探针(RGD-USPIO)[2]，并通过对15种核苷衍生物进行多细胞株体外抑瘤实验发现核苷组合(脱氧腺苷∶鸟苷∶脱氧鸟苷摩尔浓度比例为2∶1∶2)的抑瘤作用最强。本研究拟通过RGD-USPIO分子探针初步检测核苷组合的体外药效及抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 从液氮罐取出人肝癌细胞Bel-7402(购自中国科学院细胞库)，置于37℃水浴锅解冻。冻存管内液体全部溶解后，注入培养瓶，加入10倍含10%胎牛血清、青霉素(浓度为100 U/ml)及链霉素(浓度为100 μg/ml)的RPMI-1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞呈单纯贴壁生长，每隔2～3天传代1次。

1.2 细胞分组 将对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，细胞皱缩变圆后弃蛋白酶，加入培养液，终止消化，吹打细胞，并转移至15 ml离心管。将细胞接种于6孔板(1.0×105个/孔)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，直至细胞贴壁生长。将肿瘤细胞分为实验组和对照组，实验组加入1 mmol/L核苷组合3 ml，对照组加入RPMI-1640培养液3 ml，每组设3个复孔，培养48 h后，每孔加入20 μl的RGD-USPIO(Fe浓度为50 μg/ml)，培养6 h。

1.3体外细胞MR成像 将实验组和对照组与RGD-USPIO共同孵育6 h后的细胞，用PBS缓冲液漂洗3次，以0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞沉淀并分散于0.5 ml培养液中，将1%琼脂糖加温至液化状态，与分散好的细胞混匀，置于 2 ml Eppendorf管，至凝胶凝固。

采用GE Signa HDxt 3.0T超导型MR仪，头部线圈，采用FSE轴位T2WI，TR 1 820 ms，TE 120.5 ms，层厚3.0 mm，间隔1.0 mm，FOV 24 cm×24 cm，矩阵384×224，NEX 2。在同一层面沿试管内径勾画ROI(约65个像素)，测定连续3层的T2WI信号强度，取平均值。

1.4细胞内整合素ανβ3的RT PCR检测 按照RNAiso提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，NV3000 Micro-Spectrophotometer定量，逆转录合成cDNA，稀释10倍作为模板上机检测，采用RT PCR检测整合素ανβ3mRNA的表达，反应体系为25 μl：cDNA×2 μl；SYBR©Premix Ex TaqTM×12.5 μl；PF(10 μmol/L) ×0.5 μl；PR(10 μmol/L)×0.5 μl；RNase Free dH2O×9.5 μl。反应参数：预变性，95 ℃，30 s；变性，95 ℃，5 s；退火，60℃，30 s；共40个循环。以内参GAPDH mRNA循环阈值(cycle threshold, Ct)标准化整合素αvβ3mRNA的Ct值，获得整合素ανβ3mRNA的相对Ct值，采用2-△△Ct法进行计算。引物序列见表1。

1.5细胞内整合素αvβ3的Western blot检测 收集处理好的细胞，加入蛋白裂解液RIPA(Cell Signaling Technology, CST)及蛋白酶抑制剂(cocktail, Roche)，吹打均匀，冰上孵育30 min，离心，取上清并测定蛋白浓度，行100 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳(北京六一垂直电泳仪DYCZ-24DN)，然后将蛋白转印至硝酸纤维素膜(北京六一转印电泳仪DYCZ-40D)，5%脱脂奶粉溶液常温振荡并封闭2 h；加入整合素αvβ3抗体(1∶3 000)4℃孵育过夜；TBST(Tris-Buffered Saline-Tween-20)清洗10 min，清洗3次后再与以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (1∶8 000)室温孵育 2 h；采用化学发光反应试剂盒(Thermo)进行反应，暗室曝光。

图1 人肝癌Bel-7402细胞倒置显微镜观察(×200) A.对照组; B.实验组

图2 人肝癌Bel-7402细胞体外MR T2WI图像 A.对照组; B.实验组 图3 整合素αvβ3 Western blot条带 A.对照组; B.实验组

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。各组数据均符合正态分布，连续正态分布变量资料以±s表示，2组间的比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞形态观察 对照组细胞贴壁生长，细胞数较多，分布较均匀，形态规则(图1A)；实验组细胞形态变圆、体积变小，胞浆浓缩，贴壁能力差，部分已经脱落至培养液中(图1B)。

2.2体外细胞的MR成像 对照组和实验组细胞T2信号强度均值分别为241.05±15.36、997.35±42.83，实验组细胞T2信号强度明显高于对照组(t=28.79，P<0.01；图2)。

2.3细胞内整合素ανβ3的实时荧光定量PCR检测 实验组和对照组相对Ct值分别为11.44±0.66、 9.24±0.53，实验组ανβ3mRNA表达水平是对照组的 (0.22±0.02)倍，差异有统计学意义(t=4.50，P<0.01)。

2.4细胞内整合素ανβ3的Western blot检测结果 实验组蛋白条带较浅，灰度值为0.220±0.003，对照组蛋白条带较深，灰度值为0.260±0.005，差异有统计学意义(t=11.88，P<0.01；图3)。

3 讨论

恶性肿瘤已成为危害人类生命健康的重大疾病，抗瘤药物研制成为临床医学的工作重点之一。根据真核细胞核苷代谢规律，本课题组前期研究发现脱氧腺苷∶鸟苷∶脱氧鸟苷组合(摩尔浓度比例为2∶1∶2)的抑瘤作用最强，因此本研究采用浓度为 1 mmol/L的核苷组合作为抑瘤因子。

随着分子影像学技术的飞速发展，于活体内检测细胞凋亡的发生发展历程成为研究的热点[3-5]。分子影像学可在活体中示踪、检测细胞凋亡与坏死的情况，并可用于新药研发中的药物动力学、药效学分析，通过对体内的靶目标直接显像，可以简洁、无创、重复评估药物治疗的效果。因此，分子影像学的技术于新药的研发及运用方面必将发挥积极的影响[6-7]。在分子影像学方法手段中包括两个重要因素，一个是特异性分子探针的制备，另一个是可以敏感地获取高分辨图像的检测系统[8]。

选择恰当的MR分子探针靶点，是肿瘤能够成功显像的关键因素，随着对整合素配体与受体结合的深入研究，其成为了比较理想的显像靶点[9]。恶性肿瘤为细胞信号出现缺失的一类疾病，其信号依靠整合素传递，既往研究[10]报道整合素ανβ3的表达变化与肿瘤的侵袭和细胞转化相关，整合素可以通过诱导基因的表达、传导特异性信号调节控制肿瘤细胞的生长以及凋亡过程。有研究[11-13]报道发现，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)不但可以调控细胞的生长和转移，而且为锚定依赖性生长的细胞存活因子。因此，整合素ανβ3的异常表达可能是影响细胞成活及恶性肿瘤发生的重要因素。本研究进行实时荧光定量PCR检测时，实验组ανβ3mRNA表达水平是对照组的 (0.22±0.02)倍，差异有统计学意义(P<0.01)；Western blot检测时，实验组蛋白条带比较浅，对照组蛋白条带比较深，实验组肿瘤整合素ανβ3表达较对照组肿瘤的整合素ανβ3表达低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示核苷组合作用后，肿瘤细胞整合素 ανβ3的mRNA及蛋白表达均减少，推测其可能通过抑制整合素ανβ3配体—受体结合而发挥抗肿瘤作用。

每种整合素受体都有各自的特定配体，整合素ανβ3通过识别配体上一段氨基酸序列(RGD多肽序列)而结合配体，RGD多肽序列是ανβ3发挥作用的重要功能结构，因此整合素ανβ3也被称为RGD依赖的整合素[14]。根据整合素ανβ3在肿瘤的细胞凋亡过程所发挥的效用及整合素ανβ3受体和配体相识别结合的原理，笔者尝试利用以整合素为靶点的分子探针RGD-USPIO，通过MRI检测肿瘤细胞凋亡、坏死情况，从而观测核苷组合的疗效。在体外细胞MR成像过程中，细胞在试管内均匀分布时MR信号才更为准确，所以首先需制作理想的细胞模型。笔者先将细胞分散于0.5 ml培养液，再与1%的琼脂结合，琼脂在高温下成液体时混匀，冷却后自然凝固，以避免传统方法中细胞直接重悬而导致的分布不均。本研究结果显示实验组细胞T2信号强度明显高于对照组，即实验组细胞中的RGD-USPIO分子探针明显少于对照组。根据分子探针RGD-USPIO的靶向特点，对照组的靶向分子探针RGD-USPIO可通过整合素ανβ3配体—受体特异性结合的方式聚集于Bel-7402细胞，而实验组Bel-7402细胞内分子探针RGD-USPIO聚集减少，提示核苷组合可间接或直接地破坏肿瘤细胞表面的整合素ανβ3配体—受体结合部位。通过RGD-USPIO分子探针可评价核苷组合抗肿瘤的疗效，且具有简便、无创的特点。

综上所述，核苷组合通过抑制整合素配体—受体结合而发挥抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关；MR分子探针RGD-USPIO可简便、准确地评价核苷组合对Bel-7402细胞的作用。

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山东省自然科学基金(ZR2011HQ023、ZR2014HP008)、山东省卫生厅科技计划项目(2011QZ026)、山东省医药卫生科技发展计划项目(2013WS0294)。

赵荣荣(1986—)，女，山东潍坊人，硕士，医师。研究方向：分子影像学。E-mail: zhaorongrong1027@126.com

张仕状，潍坊医学院附属医院影像中心，261031。E-mail: zhangsz5712@163.com

2016-10-10

2017-04-05

MR分子探针RGD-USPIO评价核苷组合对人肝癌细胞Bel-7402的作用

赵荣荣1，韩 明2，程 鑫1，张仕状1*

(1.潍坊医学院附属医院影像中心，山东 潍坊 261031；2.潍坊医学院临床医学院，山东 潍坊 261053)

目的 利用超微超顺磁性氧化铁(USPIO)标记的含有精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)序列的环肽探针(RGD-USPIO)评价核苷组合对人肝癌细胞Bel-7402的作用效果及抗肿瘤作用机制。方法 将对数生长期的人肝癌细胞Bel-7402分为2组，实验组加入1 mmol/L核苷组合，对照组加入1640培养液，共同培养48 h后加入等量的RGD-USPIO培养6 h，行体外MR成像并测量T2WI信号强度。提取实验组和对照组的细胞总RNA和总蛋白，通过实时荧光定量PCR及Western blot检测整合素ανβ3的表达情况。结果 MR扫描显示对照组和实验组T2WI信号强度分别为 241.05±15.36、997.35±42.83，差异有统计学意义(t=28.79，P<0.01)；实时荧光定量PCR结果显示实验组αvβ3mRNA表达水平是对照组的(0.22±0.02)倍(t=4.50，P<0.01)；Western blot结果显示实验组蛋白条带较对照组浅，实验组肿瘤细胞整合素ανβ3的表达较对照组低(t=11.88，P<0.01)。结论 核苷组合通过抑制整合素配体—受体结合而发挥抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关；MR分子探针RGD-USPIO可简便、准确地评价核苷组合对Bel-7402细胞的作用。

精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸；超微超顺磁性氧化铁；核苷组合；整合素ανβ3

R445.2

A

1003-3289(2017)08-1163-04

10.13929/j.1003-3289.201610029