蝙蝠蛾拟青霉及蛹虫草与野生冬虫夏草活性比较

姜 雪，王春月，李兰洲，王 雪，滕利荣，周毓麟

（吉林大学生命科学学院，长春 130012）

蝙蝠蛾拟青霉及蛹虫草与野生冬虫夏草活性比较

姜 雪，王春月，李兰洲，王 雪，滕利荣，周毓麟*

（吉林大学生命科学学院，长春 130012）

目的 冬虫夏草是我国珍稀药用资源，具有多种药理活性。但是天然虫草产量少需求大，使其成为濒危资源。通过研究与其具有相似的化学成分和药理作用的蝙蝠蛾拟青霉和蛹虫草，可以对其进行保护。方法 利用野生冬虫夏草、蝙蝠蛾拟青霉和蛹虫草的有效成分含量测定，抗疲劳活性，免疫增强活性及体外降血糖活性研究进行比较。结果 3种虫草均含有多糖，腺苷和虫草酸；此外，蝙蝠蛾拟青霉和蛹虫草中的多糖及虫草酸含量均与冬虫夏草相当；冬虫夏草具有显著的降血糖活性、抗疲劳活性和免疫增强活性；蝙蝠蛾拟青霉具有很好的降血糖活性和抗疲劳活性；蛹虫草具有显著的免疫增强活性和抗疲劳活性；且三者对小鼠的自主活动次数均无显著影响，表明三者均对小鼠无刺激性。结论 蝙蝠蛾拟青霉和蛹虫草与野生冬虫夏草的药理作用相似，具有很大的发展空间。

蝙蝠蛾拟青霉；冬虫夏草；蛹虫草；成分含量

目前，我国虫草的研究热点主要有两方面：一方面是从冬虫夏草中分离出菌种，通过发酵生产菌丝体，以蝙蝠蛾拟青霉为代表。蝙蝠蛾拟青霉为天然冬虫夏草中分离到的内寄生菌，是天然冬虫夏草中普遍存在的一种虫草的无性型，经过深层发酵所得的菌丝体与天然冬虫夏草的主要成分、药理作用基本相似；另一方面是人工培养蛹虫草。蛹虫草，又名北冬虫夏草、北虫草等，是虫草菌寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体及幼虫形成的虫菌复合体，与天然冬虫夏草相比，同样能够调节全身功能，促进抗体形成，提高免疫力，主要有保肺益肾养肝、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等功能[1-4]。本文从虫草有效成分含量测定，抗疲劳活性，免疫增强活性及体外等方面对蝙蝠蛾拟青霉，蛹虫草和冬虫夏草进行研究[5-8]。通过有效含量、体外糖消耗实验、自主活动、抗疲劳活性和免疫增强活性等方面对蝙蝠蛾拟青霉，蛹虫草和野生冬虫夏草的活性进行比较，以期对蝙蝠蛾拟青霉和蛹虫草的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 SYNEK GY4型酶标仪（美国伯腾公司）；BP221S型电子天平（德国塞多利斯公司）；MiniSpin型高速离心机（德国Eppendorf公司）；GSY−II型恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；小型粉碎机FW-100（天津泰斯特）小鼠自主活动测试仪ZZ-6（成都泰盟）；小鼠疲劳转棒仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；动物跑步机FT-200（成都泰盟软件有限公司）；SPD−10A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.1.2 材料 菌种：蛹虫草子实体（购于沈阳乾翔有限公司），蝙蝠蛾拟青霉（本实验室发酵获得），野生冬虫夏草（来自西藏那曲冬虫夏草原产地）。动物：健康balb-c小鼠80只，雌雄各半，购自吉林大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK（辽）2014-001。试剂：0.25 %胰蛋白酶（购于北京奥博星），二甲基亚砜（购于国药集团化学试剂有限公司），噻唑蓝（购于上海源叶生物科技有限公司）。试剂盒：Mouse IL-2 Elisa Kit（购于美国RND公司），葡萄糖试剂盒-GLU（长春汇力，YZB/国 0760-2003，批号：20060226）。

1.2 试验方法

1.2.1 有效成分含量测定[9-10]采用小型粉碎机粉碎冬虫夏草、蝙蝠蛾拟青霉、蛹虫草子实体，粉末过40目筛。将蝙蝠蛾拟青霉，蛹虫草和野生冬虫夏草分别在40 ℃热水浸提，液料比（mL:g=40:1），提取3 h，提取液8 000 r/min离心10 min，收集上清液，沉淀重复提取1次，提取液经过40 ℃减压浓缩，冷冻干燥得到固体粉末的蝙蝠蛾拟青霉，蛹虫草和野生冬虫夏草，并采用高效液相色谱法测定3种虫草中所含的腺苷，苯酚-硫酸法测多糖含量，比色法测提取液中虫草酸的含量。

1.2.2 体外糖消耗实验研究[11-12]HepG2 细胞用含10 %胎牛血清的 DMEM 高糖培养基在37 ℃，5 %的CO2条件下培养，隔天更换细胞培养液。待细胞增值到80 %左右，PBS 冲洗 3 遍，加0.25 %含 0.02 % EDTA的胰蛋白酶消化。选取对数生长期的细胞，将HepG2 细胞以104 个/孔 接种于 96 孔板中。本实验设置正常对照组、蛹虫草水提物组、野生冬虫夏草子实体水提物组、蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提物，3个实验组的剂量分为125、250、500 µg/mL 3个浓度。培养24 h后，弃去培养基，各组分别加入不同的含药培养基，正常对照组加不含血清的培养基。继续于在37 ℃，5 % CO2条件下培养24 h ，测定培养基中的葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量。检测结束后，每孔加入20 µL 5 mg/mL MTT 溶液，继续培养4 h，小心吸弃培养基，加 150 µL DMSO，充分震荡使其完全溶解，490 nm 下测定吸光度，计算细胞存活率，达到 90 % 以上即认为此浓度对细胞活力无明显影响。

1.2.3 饲养动物 健康balb-c小鼠80只，雌雄各半，随机分为4组，每组20只，分别灌胃蛹虫草子实体水提物（CM，0.5 g/kg），野生冬虫夏草子实体水提物（CS，0.15 g/kg）和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提物（PHC，0.2 g/kg），灌胃7 d后进行实验研究。

1.2.4 自主活动研究 将各组灌胃后小鼠置于安静阴凉处，静置30 min，放入自主活动箱中，盖上避光板，使小鼠适应2 min后，记录小鼠5 min内的站立次数和活动次数，5 min后，将小鼠取出，打印测试结果。

1.2.5 抗疲劳活性研究[13-14]耐力跑实验：末次给药后30 min，将小鼠置于FT-200动物跑步机中，放置好动物后，对小鼠进行训练，使其了解逃离带电区域，将转速设为20 r/min，电流调到最高，记录小鼠5 min内被电击的次数。疲劳转棒实验：末次给药30 min后，将各组小鼠分别放在转棒仪上，使肌肉处于静力紧张状态，20 r/min。各组小鼠进行实验前，对其进行适当训练，小鼠在转棒上跌落3次后，开始记录小鼠由于肌肉疲劳从转棒上跌下的时间。负重游泳实验：末次灌胃后30 min，将小鼠放入水中游泳，水深30 cm，水温（25±1.0）℃，鼠尾根部负荷5 %体质量的铅块，记录小鼠自游泳开始至力竭，作为小鼠的力竭游泳时间。以小鼠头部沉水后超过8 s还无法上浮，并且放在平面上不能完成翻正反射作为力竭判断标准。

1.2.6 免疫增强活性研究[15-16]小鼠眼眶取血，用Mouse IL−2 Elisa Kit试剂盒检测小鼠血浆中IL-2含量，450 nm处测定OD值，比较3种虫草对小鼠IL-2含量的影响。

2 结果

2.1 有效成分含量检测结果 见表1。

表1 有效成分含量检测结果 %

结果表明：从3种有效成分的含量检测中可以看出蛹虫草和蝙蝠蛾拟青素的主要化学成分与野生冬虫夏草相似。

2.2 体外糖消耗实验研究结果 见表2。

表2 对Hep-G2细胞糖消耗率的影响 %

结果显示，在浓度相同的情况下，蝙蝠蛾拟青素菌丝体水提物对Hep-G2细胞的糖消耗率影响最为明显，即有显著的降血糖活性，野生冬虫夏草水提物次之，蛹虫草水提物的影响最弱。

2.3 自主活动结果 蛹虫草子实体（CM）明显减少小鼠5 min内的站立的次数（P＜0.05），说明对小鼠的中枢神经系统产生了一定程度的抑制效应，其安全性有待进一步研究；野生冬虫夏草（CS）子实体与蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提物（PHC）对小鼠5 min内站立与自主活动次数均无显著影响，说明二者对小鼠的中枢神经系统无刺激性，具有良好的安全性。

2.4 抗疲劳活性研究结果 与空白组相比，蛹虫草子实体（CM）和蝙蝠蛾拟青霉水提物（PHC）能显著提高小鼠的游泳时间，减少小鼠所受电击的次数并提高了疲劳转棒时间，具有极好的抗疲劳活性。野生冬虫夏草能减少小鼠所受电击的次数（P＜0.05），提高小鼠的疲劳转棒时间(P＜0.05)。上述实验结果可以看出，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体,蛹虫草子实体与野生冬虫夏草均具有明显的抗疲劳活性。

2.5 免疫增强活性研究结果 小鼠血浆中的IL-2水平有所提高（P＜0.05），证明蛹虫草子实体和野生冬虫夏草对小鼠有一定的免疫增强活性，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提物对小鼠血浆IL-2水平无显著性影响，初步证明蝙蝠蛾拟青霉（PHC）不能够增强正常小鼠机体的免疫活性。

3 小结

本实验结果显示，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提物，蛹虫草子实体与野生冬虫夏草均属于虫草类真菌，都含有多糖，腺苷和虫草酸，且蛹虫草和蝙蝠蛾拟青霉中多糖和虫草酸的含量与野生冬虫夏草相当[17]。初步证明二者可以起到与野生冬虫夏草相当的保健效果。在浓度相同的情况下，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提物对Hep-G2细胞的糖消耗率影响最为明显，即有显著的降血糖活性，野生冬虫夏草水提物次之，蛹虫草水提物的影响最弱，故蝙蝠蛾拟青霉可以作为降血糖药物，同时还具有一定的抗疲劳活性，无刺激性且安全性较高。蛹虫草具有显著的抗疲劳活性和免疫增强活性，但对小鼠有一定的刺激，安全性有待进一步研究。综合以上结果可以得出，蝙蝠蛾拟青霉水提物和蛹虫草子实体在医疗和保健领域具有很大的发展空间，二者的进一步开发利用将为人类的医疗事业乃至生态环境带来一大进步。

[1] HE JL. Review on the evaluateion standard of body fatigue[J]. 2013, 34(2): 29-31.

[2]吴敬梅, 李燕平, 瞿亮, 等. 冬虫夏草甘露醇含量的高效液相色谱法测定[J]. 食药用菌, 2016, 24(6): 388-392.

[3]樊晓飞, 杨明, 姜磊, 等. 蝙蝠蛾拟青霉菌丝体化学成分的研究[J]. 菌物研究, 2013, 11(2): 72-77.

[4]江海涛, 任源浩, 吴雨龙, 等. 蛹虫草多糖对小鼠抗疲劳作用的研究[J]. 食用菌学报, 2014, 21(3): 55-59.

[5]许宇辉, 梁慧春, 杨征. 蝙蝠蛾拟青霉菌丝体抗小鼠力竭疲劳作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2014, 28(3): 351-357.

[6]胡贤达, 黄雪, 王彪, 等. 冬虫夏草抗肿瘤及免疫调节作用的研究进展[J]. 药物评价研究, 2015, 38(4): 448-452.

[7]赵施施, 张科学, 包素红, 等. 丙泊酚对幼小鼠自主活动和学习记忆行为的影响[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(2): 198-201.

[8]蔡溱, 陈方剑, 陆松伟, 等. 冬虫夏草胶囊对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J]. 解放军药学学报, 2014, 30(2): 118-121.

[9]孟泽彬, 陈林会, 韩近雨, 等. 蛹虫草化学活性成分的研究进展[J]. 分子植物育种, 2015, 13(9): 2147-2154.

[10]张姝, 张永杰, BHUSHAN S, 等. 冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望[J]. 菌物学报, 2013, 32(4): 577-597.

[11]黄丽俊, 李利东, 袁建新, 等. 冬虫夏草研究现状及展望[J].农学学报, 2014, 4(8): 63-65.

[12]王米, 张丽芳, 杨锐乐, 等. 蛹虫草多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖及IL-2和INF-γ分泌的影响[J]. 中国兽医科学, 2015, 45(8): 848-853.

[13]朴美子, 王晓东. 蛹虫草黄豆对小鼠的抗氧化及免疫作用[J].中国食品学报, 2014, 14(5): 32-37.

[14]汪宇, 杨光照, 康万军, 等. 高效液相色谱法测定天然冬虫夏草和蛹虫草及其人工培养物中3个核苷类化合物含量[J].中国医院药学杂志, 2015, 35(9): 805-808.

[15]栾洁, 陈雅琳, 储智勇, 等. 冬虫夏草子实体对小鼠抗疲劳及耐缺氧能力的影响[J]. 时珍国医国药, 2013, 24(1): 47-48.

[16]许宇辉, 梁慧春, 温泉, 等. 蝙蝠蛾拟青霉菌丝体对小鼠体力疲劳及缺氧的影响[J]. 军事医学, 2014, 38(10): 784-790.

[17]阴婉婷, 李彤, 马辰. 改良的苯酚-硫酸法测定蛹虫草多糖含量[J]. 安徽农业科学, 2015, 43(4): 117-118, 173.

Activity comparisonstudy onPaecilomyces Hepiali, Cordyceps Militaris and Wild Cordyceps Sinensis

JIANG Xue, WANG Chunyue, LI Lanzhou, WANG Xue, TENG Lirong, ZHOU Yulin*
(College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China)

Objective Cordyceps sinensis is a rare medicinal resource in our country which has a wide range of pharmacological activities. But natural Cordyceps sinensis has less yield and large market demand, which becomesan endangered resources. We can protect Cordyceps sinensis by studying Paecilomyces hepialid and chinese caterpillar fungus, which have similar chemical composition and pharmacological effects with Cordyceps sinensis. Methods Compare Paecilomyces hepialid and Cordyceps Militaris with Wild Cordyceps Sinensis on active components, antifatigued action, immuno-enhancing activity and in vitro hypoglycemic activity. Results All of this three caterpillar funguses have polysaccharides, adenosine and cordycep, moreover, the content of cordycep and polysaccharides in Paecilomyces hepialid and Cordyceps Militaris are equivalent with those in Cordyceps Sinensis; Cordyceps sinensis has great hypoglycemic activity, immuno-enhancing activity and anti-fatigued activity; Paecilomyces hepialid has great anti-diabetes activity and some anti-fatigued activity; Cortices militaris has great immuno-enhancing and antifatigued activity; And they all have no signifcant effect on mice’s autonomic activities, which indicates that they have no irritation on mice. Conclusion The pharmacological action of Paecilomyces hepialid and Cortices militaris is similar to that of Cordyceps sinensis, which has great potential for development.

Paecilomyces hepialid; Cordyceps Sinensis; Cordyceps Militaris; component content

R285.1

A

2095-6258(2017)04-0544-04

2016-11-02）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.010

吉林省“双十工程”重大科技成果转化项目“冬虫夏草菌的发酵粉关键技术攻关及产品开发”（20130201006ZY）。

姜 雪（1994 -），女，硕士研究生，主要从事微生物与生化药学研究。

*通信作者：周毓麟，男，硕士，电话-13756146186，电子信箱-zhouyl@jlu.edu.cn