蜗牛肠道细菌及其纤维素酶性质

昌艳萍，田其凡，郭欣，李彦芹，闫蕾蕾，李春青

(河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002)

蜗牛肠道细菌及其纤维素酶性质

昌艳萍，田其凡，郭欣，李彦芹，闫蕾蕾，李春青

(河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002)

为了探寻功能微生物,用几种不同培养基分离蜗牛肠道可培养细菌并筛选纤维素降解细菌，研究了纤维素酶学性质.结果表明，LB培养基培养蜗牛肠道细菌时菌落种类和数量最多，达3.3×104CFU/mL.刚果红染色显示，7种优势细菌全部具有产酶能力；菌S6粗酶液的内切葡聚糖酶(Cx)和滤纸酶(FPase)活性最高,分别为5.96和2.84 U/mL.对Cx酶学性质初步研究表明：该酶最适反应温度为35 ℃，在55 ～75 ℃时有较高的热稳定性；最适pH为6.0，在pH 3.0～8.0均有酶活力，pH 8.0相对酶活仍为60%；Mg2+、Na+、K+和Ca2+对酶反应具有促进作用，Zn2+、Cu2+和Mn2+为酶反应的抑制剂.研究蜗牛肠道细菌的组成，从中分离高产纤维素酶菌株，为纤维素生物降解转化成可再生能源寻找新的思路.

条华蜗牛; 肠道细菌; 产酶能力; 纤维素生物降解

在资源与环境的双重制约压力下，来源于秸秆生物质产品的开发利用引起越来越多学者的关注[1].中国秸秆数量巨大，秸秆在短期内不易腐解，在以种植业为主的地区作物秸秆已经成为生产中的障碍.农业部、国家发改委为了推进秸秆综合利用，加快实现秸秆的资源化、商品化，促进资源节约、环境保护和农民增收，于2009年2月9日制定了《编制秸秆综合利用规划的指导意见》.因此加大秸秆的利用是农业和能源发展的必然选择. “秸秆利用”说得那么好，为何就是推不开? 主要原因是秸秆中木质纤维素不易被降解，在木质纤维素的生物转化过程中，其水解糖化是关键技术之一，目前最为有效的方法是酶解.然而，低效高昂的酶制剂极大地限制了以木质纤维素为原料的生物质产品生产技术的发展.本实验旨在筛选高效分解天然木质纤维素且具有高效分泌胞外酶能力的微生物，以期为分解酶制剂的开发和木质纤维素资源的高效分解利用提供新的思路和实践探索.

目前的研究表明，细菌、真菌、原生动物、昆虫和软体动物等均能够产生纤维素酶[2-3].植食性动物自身并不产生纤维素酶[4]，而是依赖其消化道共生生物，如细菌、真菌和原生动物产生的纤维素酶降解纤维素.多种微生物生长繁殖的理想场所是动物肠道，正常肠道微生物对宿主具有生长刺激、生物拮抗、营养、免疫等作用，也是机体的生理组成部分[5].蜗牛属于软体动物门，腹足纲，大蜗牛属.蜗牛饲养方便，以摄取富含纤维素的植物性材料为主，来源简单，繁殖较快，蜗牛消化道含有多种降解多糖的水解酶，可将纤维素水解为各种小分子糖.

没有任何一种培养基能满足所有微生物的营养要求，本研究以蜗牛肠道细菌为研究对象，通过不同的培养基培养，以便尽可能全面了解蜗牛肠道可培养微生物的数量和种类，同时为分离纯化高产纤维素酶细菌的研究提供了新思路.研究蜗牛肠道细菌的组成，从中分离高产纤维素酶菌株.

1 材料与方法

1.1 蜗牛样品采集及鉴定

实验蜗牛采自河北大学花园草丛中，对采集的蜗牛的贝壳大小、壳质形态、螺层数量及壳面颜色等形态特征进行观测和鉴定.

1.2 实验用培养基

为了尽可能了解蜗牛肠道细菌的种类和数量，本实验用以下3种培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6)；LB培养基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2)；SOB培养基(胰化蛋白胨20 g，酵母提取物5 g，NaCl 0.5 g，KCl 2.5 mmol，琼脂15 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，使用前，加入5 mL灭菌的2 mol/L MgCl2).发酵产酶培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH值.

1.3 蜗牛肠道菌的分离与培养

取5只饥饿24 h中等大小的蜗牛，于无菌操作台上，用体积分数75%的酒精棉球擦拭蜗牛体表3次，将蜗牛外壳敲碎，用镊子轻轻将碎了的蜗牛壳取下，将去掉外壳的蜗牛浸入体积分数75%的乙醇中消毒，移入无菌水中漂洗2次.顺着蜗牛蜷缩的身体，将蜗牛展开，寻找蜗牛的肠道.一般蜗牛的肠道较长且细，里面的食物清晰可见.将切下来的肠道用无菌水漂洗2次，然后放入研磨缸里研磨.将肠道研磨碎后，加入1 mL无离子水搅匀.按10倍稀释法将肠液稀释后取原液、10-1和10-23个连续稀释度各0.2 mL直接涂布于上述各种固体培养基上，各稀释度重复3次，于28 ℃培养箱中培养72 h，挑取表征各异的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上划线、纯化和培养.将纯化后菌落再分别移植斜面培养，并按照表征依次编号.

1.4 不同菌落羧甲基纤维素(CMC)水解圈的测定及初步分析

将1.3分离出的菌株分别接在CMC培养基筛选板上培养72 h，10 g/L刚果红染色0.5 h，观察并测定记录水解圈大小，比较各菌株CMC-Na的相对酶活A(图1) [A=水解圈的直径(D)/菌落的直径(d)]，以A值的大小为参考依据，判断细菌产纤维素酶的能力，即比值越大，表示该菌株的产纤维素酶的能力越大；反之越小.

图1 部分纤维素降解菌在刚果红培养基的水解圈Fig.1 Hydrolyzing circle produced by partial degrading celluloses strains on Congo red medium

1.5 菌株产纤维素酶复筛

取1环1.4初筛产纤维素酶能力较大的菌株S6接种到100/250 mL液体种子培养基中，28 ℃、150 r/min条件下培养48 h，然后按10%接种量转接于100/250 mL发酵培养基中，于28 ℃、150 r/min条件下培养3 d，等发酵结束后，5 000 r/min冷冻(4 ℃)离心10 min，取上清液得粗酶液，参照田敏等[6]方法稍作改进，测定各菌株的内切葡聚糖酶(Cx)和滤纸酶(FPase)的酶活，进行复筛.这2种酶的酶活定义为：1 mL粗酶液1 h催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位，用U表示.Cx的活力用 CMC-Na为底物进行测定；FPase活力以去淀粉的滤纸为底物进行测定.

1.6 纤维素酶酶学特性初步分析

提取产酶能力最大的菌株S6的粗酶液，按照1.5描述的方法测定CMC酶的酶活，分析酶的热稳定性、酶的pH稳定性以及终浓度为1 mmol/L不同金属离子对纤维素酶活力的影响.

2 结果与分析

2.1 蜗牛样品鉴定

所采集蜗牛贝壳中等大小，呈低圆锥形，壳面黄色或者黄褐色，壳顶尖缝合线明显.有5～5.5个螺层，各螺层膨胀，初步鉴定该蜗牛为陆生腹足纲，柄眼目，巴蜗牛科的条华蜗牛[7].

2.2 蜗牛肠道细菌的组成特点及其产纤维素酶活性大小

用不同的培养基培养了蜗牛肠道细菌，分离得到了7种不同特征的肠道菌落，其菌落形态特点和菌落数量如表1、表2所示.表中显示，LB培养基培养蜗牛肠道细菌时菌落种类和数量最多，其次是牛肉膏蛋白胨培养基，而SOB培养基培养时显示统计的细菌菌落种类最少.S3菌落即边缘规则、隆起、淡白色、光滑菌落是优势菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基和SOB培养基所占比例最高，分别为90.7%、72.5%和80.6%.

表1 可培养细菌菌落的菌落特征及其在CMC筛选结果

+表示有这种类型的菌落，-表示没有这种类型的菌落

表2 优势菌S3在各培养基中分离的菌落数量

图2 各测试菌的2种酶活Fig.2 Two kinds of enzyme activities of test bacteria

2.3 细菌产纤维素酶活性大小

在CMC 培养基平板中加入刚果红溶液进行染色，并以相对酶活A的大小为参考依据，判断细菌产纤维素酶的能力，结果见表1.从蜗牛肠道分离出的7种不同特征菌都能产纤维素酶，从表1看出菌落S3的A值最高，而菌落S4的A值最低，取其中A>2的6种菌进一步进行复筛.

2.4 菌株产纤维素酶复筛

用DNS法测定各菌粗酶液的Cx和FPase的酶活，结果见图2. 菌S6发酵72 h后，其粗酶液的Cx和FPase的酶活最大，分别为5.96和2.84 U/mL，菌S1粗酶液的Cx和FPase的酶活最小，分别为5.06和2.45 U/mL，可以看出，各测试菌纤维素酶的酶活有差别，但是相差不明显.

2.5 酶学特性分析

2.5.1 酶反应的热稳定性

不同温度对CMC酶酶活反应的影响见图3.图3显示，随着温度上升，纤维素酶活力也随之上升，35 ℃是纤维素酶的最佳反应温度，同时看出此菌分泌的纤维素酶在15～75 ℃均有酶活力，并且在55～75 ℃时相对酶活为30%左右, 说明此菌分泌的纤维素酶具有较强的高温耐受性.

2.5.2 酶反应的pH稳定性

在最佳温度35 ℃下，测定不同的pH对CMC酶酶活反应的影响，结果见图4.由图4可以看出，纤维素酶活力刚开始随着pH值的增大而下降，而后上升，最适反应pH为6.0.此菌分泌的纤维素酶在pH 3.0～8.0均有酶活力，pH 8.0相对酶活仍为60%，说明此菌分泌的纤维素酶pH范围广泛，无论是酸性还是碱性条件都具有一定酶活力.

图3 温度对纤维素酶活力的影响Fig.3 Influence of enzyme activity from different temperatures

图4 pH值对纤维素酶活力的影响Fig.4 Influence of enzyme activity from different pH

2.5.3 金属离子对纤维素酶活力的影响

在上述最佳反应温度和最佳pH下测定酶活力，以未加金属离子的酶活力定义为100%，计算加入不同金属离子后的相对酶活力，结果见图5.从图5可知，Mg2+、Na+、K+和Ca2+对纤维素酶反应具有促进作用，其中Mg2+的促进作用显著，相对酶活力为205%；Zn2+、Cu2+和Mn2+对纤维素酶反应具有抑制作用，而Mn2+的抑制作用最强，相对酶活力仅为44%.

3 讨论

蜗牛是一种低脂肪、趋零胆固醇、含30多种人体有益酶和20多种氨基酸、具有丰富的营养价值的高级保健品.中国学者首次报道从江西巴蜗牛中提取天螺多糖，并证实该多糖具有提高免疫力和明显的体外抑制HBV病毒复制的生物活性[8].此外，蜗牛含有30多种混合酶素，蜗牛酶能降解几丁质内切酶分解几丁质产物成单糖，但蜗牛肠道微生物种类和数量特别是降解纤维素的研究鲜有报道.

图5 金属离子对纤维素酶活力的影响Fig.5 Influence of enzyme activity from different metal ions

一些学者做过有关杂食性水产消化道产纤维素酶细菌区系的研究[9]，消化代谢相关的功能微生物的报道越来越多.蜗牛作为一种草食性软体生物，纤维素是其摄入的主要成分，因此，推断蜗牛需要依靠肠道中能降解纤维素的细菌来辅助其消化纤维素提供营养，通过不同的培养基培养，全面了解蜗牛肠道可培养微生物的数量和种类，并从中分离能够产纤维素酶的细菌.

纤维素降解是一个需要多种酶协同作用的复杂过程，本研究以CMC-Na和滤纸为底物，仅仅检验的是细菌产Cx和FPase的能力，因此，对蜗牛肠道纤维素降解细菌的全面研究需要运用更多的底物来分析不同的纤维素酶.

本实验发现，刚果红脱色圈直径与菌落直径的比值，和DNS法测得的酶活活性高低并没相关性(图1和表1)，表明仅用脱色圈直径与菌落直径的比值来评价纤维素酶活性的方法并不可靠.为了快速获得更多的高效产酶菌株，在筛选纤维素酶时，建议先用简单方法(如刚果红染色法)进行初筛，再用稍微复杂但精确度较高的方法(如DNS法)进行复筛.

研究表明S6菌粗酶液的Cx和FPase酶活力都最高，对温度和酸碱度都有一定的耐性，有关该菌的生物学特性以及分类鉴定见后续的研究报告.

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(责任编辑：赵藏赏)

Composition of the intestinal bacteria and their cellulase characterization inCathaicafasciola

CHANG Yanping, TIAN Qifan, GUO Xin, LI Yanqin, YAN Leilei, LI Chunqing

(College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)

In order to explore the functional microorganism, the intestinal culturable microflora inCathaicafasciolawere screened and cultured by several kinds of culture media, and the cellulase activity of the isolated bacteria and the characteristics of the crude cellulase that produced by strain S6 was studied.The results showed that the largest number of intestinal bacteria was up to 3.3×104CFU/mL in LB medium.Congo red staining showed that all the 7 dominant bacteria had the ability to secrete cellulase.The strain S6 had highest CMCase and FPase values of 5.96 and 2.84 U/mL, respectively.The CMCase characterization revealed that, the optimum reaction temperature was 35 ℃, the cellulose kept its high activity from 55 ℃to 75 ℃.The crude enzyme still had 60% of the highest obvious activation function at pH 8.0.Mg2+、Na+、K+and Ca2+had enhancing effect, and Zn2+、Cu2+and Mn2+had inhibitory action.To research the composition of the snail intestinal bacteria and separate high-yield cellulase strains is a new way for the cellulose biodegradation into renewable energy.

Cathaicafasciola; intestinal bacteria; enzyme producing capabilities; cellulose biodegradation

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.04.011

2016-12-27

河北大学博士基金资助项目(2014-276)

昌艳萍(1969—)，女，湖北仙桃人，河北大学副教授，博士，主要从事微生物技术的研究. E-mail:yanpingchang@126.com

Q939.9

A

1000-1565(2017)04-0400-05