UPLC-MS/MS法测定电子烟烟油中TSNAs的含量

陈国辉，李映梅，董胜强，杨 燕，侯 英

(1.云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，云南 昆明 650106；2.云南同创检测技术股份有限公司，云南 昆明 650106)

UPLC-MS/MS法测定电子烟烟油中TSNAs的含量

陈国辉1，李映梅2*，董胜强2，杨 燕2，侯 英2

(1.云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，云南 昆明 650106；2.云南同创检测技术股份有限公司，云南 昆明 650106)

为快速准确测定电子烟烟油中的烟草特有亚硝胺(TSNAs)，对前处理条件进行优化，建立了烟油中TSNAs的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，结果表明：使用HLB固相萃取小柱进行净化，可以很好地去除杂质干扰； NNK、NNN、NAT、NAB的检出限为0.005～0.020 ng/g，定量限为0.015～0.067 ng/g，3个加标水平的回收率为85.16%～105.79%；通过对6个不同品牌电子烟烟油中TSNAs的测定，NNN的检出率和含量是最低的，因此，该方法稳定、准确，适用于测定电子烟烟油中TSNAs的含量。

UPLC-MS/MS;TSNAs;HLB固相萃取;电子烟烟油

自2004年电子烟发明以来，全球抽吸电子烟的人数都呈现快速增长的趋势[1-3]，电子烟的品质和安全性等问题日益凸显[4-7]，各个国家也开始对电子烟进行了监管和相关的研究[8]。2016年5月5日，美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)发布了有关电子烟的新规定，将电子烟视同为烟草产品进行监管。

电子烟又名电子烟碱传送系统，电子烟的烟碱几乎都是从烟草中提取的，而TSNAs是在烟草调制和储存过程中由亚硝酸盐与烟草生物碱反应形成的[9-13]，TSNAs会引起动物鼻腔、肝、胰等组织的癌变[14-15]，对人体危害极大。TSNAs的含量极低、基质干扰大，给定量分析带来了一定的难度[16-18]。相关专利和文献报道电子烟烟油中NNK、NNN、NAT、NAB含量的测定可采用GC-MS法[9]、LC-MS/MS法[17]、RP-GC-TEA法(基质固相分散-气相色谱热能检测法)[19]。实验室根据实际情况，建立了UPLC-MS-MS准确测定电子烟烟油中的TSNAs的方法，试图通过对电子烟烟油中TSNAs含量进行对比，为准确客观评价电子烟油中TSNAs含量情况提供技术手段，对电子烟安全性的评价具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇(色谱纯，Dikma)；乙腈(色谱纯，Dikma)；乙酸(分析纯)；甲酸(分析纯)；超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm)；乙酸铵(分析纯)；氘代-4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl-d4)-1-butanone(NNK-d4，纯度≥99%)；氘代-N-亚硝基降烟碱，rac N′-Nitrosonornicotine-d4(NNN-d4，纯度≥99%)；N-亚硝基假木贼碱，(R,S)-N-Nitrosoanabasine(NAB纯度≥98%)；N-亚硝基新烟碱，(R,S)-N-Nitrosoanatabine(NAT，纯度≥98%)；4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK，纯度≥98%)；N-亚硝基降烟碱，rac N′-Nitrosonornicotine(NNN，纯度≥98%)；色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；固相萃取柱：Oasis HLB(60 mg/3 mL，美国Waters公司)；高纯氮气(纯度大于99.999%)。

液相色谱串联质谱仪：1290高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent 6460三重四级杆液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(美国Agilent公司)；分析天平(瑞士梅特勒，型号：AB204-S，感量0.1 mg)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制 各称取约10.0 mg的NNK-d4和NNN-d4，用甲醇完全溶解后，分别转移至2个10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度均为1.0 mg/mL的内标储备液。分别移取1.0 mL NNK-d4和NNN-d4的1.0 mg/mL内标储备液至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度均为10.0 μg/mL的NNK-d4和NNN-d4一级混合内标溶液。该溶液于-18 ℃条件下避光保存，有效期为6个月。

各称取约10.0 mg的NAB、NAT、NNK、NNN，用甲醇完全溶解后，分别转移至4个10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度均为1.0 mg/mL的标准储备液。该储备液于-18 ℃条件下避光保存，有效期为6个月。

1.2.2 样品处理与分析 准确称取0.2～0.5 g样品于锥形瓶中，加入5.0 mL去离子水，准确加入200 μL 100 ng/mL的内标溶液，涡旋1 min，超声5 min，1000 r/min离心5 min，上清液待净化，Oasis HLB固相萃取小柱预先依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，将上清液全部倒入固相萃取小柱中，待样品溶液自然流尽后，用3 mL 2%甲醇水溶液淋洗，最后用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液氮气吹干，加入2.0 mL浓度为0.1 mol/L的乙酸铵溶液超声溶解，经0.2 μm滤膜过滤至进样瓶中，待测定。

高效液相色谱参考条件：色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%的乙酸溶液,梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序

质谱参考条件：离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：5000 V；各分析物质谱检测参数见表2。

表2 TSNAs及内标物的质谱检测参数

2 结果与分析

2.1 前处理条件的确定

2.1.1 萃取方式的优化 目前，常用的提取净化方法为直接使用乙酸铵水溶液过滤进样，笔者验证了该方法，这种方法对于添加了烟草提取物的烟油净化不足，有很大的基质干扰，定量和定性都不准确。在CORESTA建议的方法中，水溶液提取后，使用HLB固相萃取小柱进行净化，在验证该方法后，对杂质有较强的去除效果，因此选择该方法作为提取净化电子烟烟油方法。

2.1.2 萃取时间的优化 加入水提取时间设定为0、5、10、15、30 min，考察不同提取时间对提取效果的影响。结果表明，超声5 min后检测结果并没有变化，因此，选择5 min作为超声时间。

2.2 方法评价

2.2.1 线性关系和检出限 配制浓度为0.20～50 ng/mL系列浓度的TSNAs标准混合工作溶液，用液相色谱串联质谱测定，得到TSNAs积分峰面积，以峰面积作为纵坐标，用于制作标准曲线，对校正数据进行线性回归，回归方程和相关系数见表3。

检测器产生的响应信号为噪声值3倍时的量为检出限，检测器产生的响应信号为噪声值10倍时的量为定量限，并通过定容体积和样品量换算得到样品的检出限和定量限，具体见表3。

从表3可以看出，TSNAs的相关系数大于0.999，表明在一定浓度范围内线性关系良好，检出限和定量限较低，说明该方法的检出限和定量限低于文献报道的数值，因此，该方法有较好的灵敏度、较低的检测限，能够很好地满足检测的要求。

表3 标准曲线线性方程、相关系数、检出限和定量限

注:线性方程中的A为峰面积，C为各组分的浓度，单位为ng/mL。

表4 TSNAs的重现性结果

2.2.2 重复性与重现性 选取样品称取6次，样本进行前处理，测定TSNAs含量，在相同条件下进行3 d的测定，其日内和日间的相对标准偏差见表4。由表4可知，该方法的连续3 d的RSD在2.10%～8.69%之间，3 d的RSD分别为6.28%、6.08%、5.42%和7.50%，说明该方法对TSNAs的测定具有较好的重现性。

2.2.3 回收率 采用加入TSNAs标准物质低、中、高3个梯度(20、50、200 ng/g)进行加标实验，验证该方法的准确性，每个浓度平行进行3次实验，分别得到了TSNAs的回收率(表5)。由表5可知，建立的分析方法回收率86.74%～105.79%，满足电子烟烟油中TSNAs含量的检测要求。

2.3 样品检测

采集了市场中的6种烟油进行了检测，结果见表6，对实际样品进行了TSNAs检测，4种TSNAs含量都较低，表明这可能与该烟油配方中加入烟草提取物含量有关。TSNAs在样品中均有不同程度的检出，NNN的检出率和含量均是最低的，该规律类似于烟草制品[20]。

表5 TSNAs的加标回收率

表6 6个电子烟油样品中TSNAs检测结果 ng/g

注:N.D表示未检出或低于检出限。

3 结论

实验室通过优化前处理，选择HLB固相萃取小柱进行净化，建立了超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法测定电子烟烟油中TSNAs的方法。得出以下结论：(1)检出限和定量限较低、重现性较好、回收率较好，能够满足电子烟烟油中TSNAs含量的检测要求；(2)通过对实际样品的检测，NNN的检出率和含量均是最低的，这个规律类似于烟草及烟草制品。

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(责任编辑：曾小军)

Determination of Tobacco-specific N-nitrosamines (TSNAs) Content in Electronic Cigarette Liquid by Using UPLC-MS/MS Method

CHEN Guo-hui1, LI Ying-mei2*, DONG Sheng-qiang2, YANG Yan2, HOU Ying2

(1. Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Limited Company, Kunming 650106, China; 2. Yunnan Comtestor Detection Technology Limited Company, Kunming 650106, China)

An improved method was developed to rapidly and accurately determine four kinds of tobacco-specific N-nitrosamines (TSNAs) in electronic cigarette liquid by using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method. The results showed that using HLB solid-phase extraction column could well purify the TSNAs in electronic cigarette liquid. The limit of detection for NNK, NNN, NAT and NAB in samples was 0.005～0.020 ng/g, and the limit of their quantification ranged from 0.015 ng/g to 0.067 ng/g. The recovery of 3 analytes varied from 85.16% to 105.79%. This method was used for the determination of TSNAs content in the liquid of 6 brands of electronic cigarette, and it was found that both the detection rate and the content of NNN were the lowest. Therefore, this method is stable and accurate, and it is suitable for the determination of TSNAs content in liquid of electronic cigarette.

UPLC-MS/MS; TSNAs; HLB solid-phase extraction; Electronic cigarette liquid

2017-04-27

陈国辉(1983─)，男，山东聊城人，工程师，硕士研究生，从事卷烟及其制品的研究和检测工作。*通讯作者：李映梅。

O657.63

A

1001-8581(2017)08-0110-04