外周血中Th17/Treg细胞及炎症因子水平与宫颈病变程度、HPV危险分型的关系

樊金焱，刘玉玲，邰国香，孙选，杨德胜

(青岛市海慈医疗集团，山东青岛266033)

·临床研究·

外周血中Th17/Treg细胞及炎症因子水平与宫颈病变程度、HPV危险分型的关系

樊金焱，刘玉玲，邰国香，孙选，杨德胜

(青岛市海慈医疗集团，山东青岛266033)

目的 探讨外周血辅助性T17细胞/调节性T细胞(Th17/Treg细胞)及炎症因子水平与宫颈病变程度、人乳头瘤状病毒(HPV)危险分型的关系。方法 宫颈病变患者120例，根据HPV危险分型分为高危型组82例，低危型组38例；根据病理分型分为宫颈癌(CC组)47例、宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ(CIN组)45例、慢性宫颈炎(CCS组)28例，检测各组外周血Th17/Treg细胞及血清炎症因子IL-17、IL-10、转化生长因子β(TGF-β)、IL-23水平，分析外周血Th17/Treg细胞与炎症因子及宫颈病变程度和HPV感染危险分型的相关性。结果 CC组与CIN组外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及Th17/Treg细胞，血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均较CCS组高，且CC组亦高于CIN组(P均<0.05)。高危型组外周血上述指标均高于低危型组(P均<0.05)。Pearson相关分析结果显示，外周血Th17/Treg细胞与血清IL-17、TGF-β、IL-23水平及宫颈病变程度、HPV感染危险分型均呈正相关(r分别为0.658、0.592、0.714、0.649、0.707，P均<0.05)。结论 外周血Th17/Treg细胞及炎症因子水平升高与宫颈癌变、HPV感染高危型有关。

宫颈病变；辅助性T17细胞；调节性T细胞；人乳头瘤状病毒

宫颈癌为临床妇科常见恶性肿瘤，且呈年轻化趋势发展，逐渐成为当前社会关注重点。临床研究发现，约90%或以上宫颈癌患者合并伴有高危类型HPV感染[1，2]。因此，宫颈癌发病与HPV感染之间存在密切联系，同时，伴随宫颈HPV疫苗顺利研制问世并得以临床应用，有关宫颈癌的免疫疗法逐渐成为研究热点。虽然关于HPV免疫逃逸主要机制尚未明确，但已有多项报道证实，辅助性T17(Th17)细胞以及调节性T(Treg)细胞均参与宫颈癌HPV免疫逃逸过程，且宫颈癌患者Th17及Treg细胞水平发生明显变化[3]。有学者提出，Th17/Treg细胞和宫颈病变HPV感染之间存在一定相关性，对其进行深入研究探讨，有助于宫颈癌治疗及预防工作顺利进行，并且有助于HPV感染临床病情预测[4，5]。2014年3月～2016年12月，本文探讨了外周血Th17/Treg细胞及炎症因子与宫颈病变程度、HPV危险分型的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 宫颈病变患者120例。根据宫颈病变程度分为宫颈癌(CC组)47例，年龄35～61(46.82±1.33)岁；上皮内瘤变(CIN)Ⅱ～Ⅲ 45例(CIN组)，年龄36～63(46.77±1.53)岁；慢性宫颈炎(CCS)28例(CCS组)，年龄37～60(46.59±1.41)岁。经HPV检测分型显示高危型82例(高危型组)、低危型38例(低危型组)。纳入标准：患者均经病理诊断结果证实有宫颈病变；均为初诊患者。排除标准：有糖尿病亦或是高血压者；有心血管类疾病者；处于妊娠期的患者；有急慢性感染性疾病者；有转移性肿瘤者。

1.2 宫颈HPV检测 采用专用的宫颈刷在宫颈放置后，旋转5～10圈后，将收集到的脱落细胞存于专用保存液内，利用PCR技术实施HPV分型的检测。

1.3 血清CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比的检测 所有受试者采集其空腹静脉血约3 mL，经EDTA抗凝，在测定管内分别添加抗凝血100 mL，而后加进对应抗体10 μL/管，经避光、室温下孵育约20 min。添进Foxp3 荧光抗体约20 μL，在避光和4 ℃下静置约30 min，添进破膜剂约2 mL洗涤，予以1 200 r/min离心5 min。再弃去上清液，添加细胞染色液约2 mL，共洗涤2次，将重悬细胞染色液0.5 mL进行混匀，利用流式细胞仪对样本实施检测。

1.4 血清CD4+IL17+Th17细胞百分比的检测 将BPMI1650型培养基调至细胞浓度为2×106/mL，而后接种在24孔培养板，之后添加佛波醇乙酯约25 ng/mL及离子霉素约1 μg/mL，以及莫能霉素约1.7 μg/mL。于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养约5 h，调节细胞到1×107/mL。提取测定的试管和对照试管各一支，而后分别加进细胞悬液100 μL及FitcCD4 10 μL，经避光室温下孵育约15 min，再行PBS洗涤1次，在两管内依次加进细胞破膜剂200 μL，经室温避光孵育约15 min后，给予PBS洗涤1次，再重悬细胞，在检测试管内添加破膜剂200 μL及PE-IL17A 10 μL，在对照试管内加进破膜剂200 μL及对照抗体PE 10 μL，经室温避光下孵育约15 min，再行PBS洗涤1次，通过流式细胞仪对样本实施检测。

1.5 血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平的测定 取患者血清约3 mL，严格依据ELISA试剂盒说明书实施操作，依次测定血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平，通过酶标仪在450 nm位置读取光密度(OD)值，依照标准曲线算出浓度。

2 结果

2.1 不同类型宫颈病变患者外周血Th17、Treg细胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比较 见表1。

表1 各组外周血内Th17、Treg细胞百分比及血清炎症因子水平比较±s)

注：与CCS组相比，*P<0.05；与CIN组相比，△P<0.05。

2.2 不同HPV危险分型患者外周血Th17、Treg细胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比较 见表2。

2.3 相关性分析 Pearson相关分析结果显示，外周血Th17/Treg细胞与血清IL-17、TGF-β、IL-23水平、宫颈病变程度以及HPV危险分型均呈正相关(r分别为0.658、0.592、0.714、0.649、0.707，P均<0.05)。

表2 不同HPV感染危险分型患者外周血Th17、Treg细胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比较

注：与低危型组比较，*P<0.05。

3 讨论

宫颈癌为女性高发癌症，对全世界女性生命健康以及安全造成重大威胁，伴随人们生活方式改变以及饮食习惯变化，我国宫颈癌发病率近年也不断攀升，其治疗及预防工作受到高度重视。根据流行病学相关研究发现，多数妇女均有HPV感染史，并且高危型HPV持续感染为宫颈癌发病的重要诱因[6，7]。但是，当HPV感染机体后，通常会遭到宿主免疫清除，剩余者保持长期感染状态[8～10]。同时，仅少数高危类型HPV持续性感染者最终发展为宫颈癌。专家认为，导致宫颈癌发病的最重要原因在于宫颈HPV免疫逃逸。已知多种T淋巴细胞在恶性肿瘤微环境内担任重要角色，Th17细胞与Treg细胞同属T细胞亚群。其中Th17细胞能够释放出IL-17类型细胞因子，进而起到促炎症作用。Treg细胞则能够发挥免疫抑制效果。宫颈癌患者Th17与Treg细胞水平失衡，提示Th17与Treg细胞有可能参与了宫颈HPV免疫逃避，但二者关系仍需深入探讨。

本研究发现，CC组与CIN组外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的百分比及Th17/Treg细胞以及血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均较CCS组高，且CC组亦高于CIN组，与张剑英等[11～13]研究结果一致。提示患者的宫颈病变程度与机体的免疫细胞及细胞炎症因子紧密相关。Th17细胞为T淋巴细胞亚群中一员，其为关键性介导炎症类细胞，与多种自身免疫类疾病以及感染类疾病密切相关，可诱导炎症反应，并产生多种炎症介质，如IL-17。已知IL-17为重要的诱导炎症介质以及趋化因子，其具有造成组织细胞发生炎性损伤的作用。Treg细胞属于CD4类型细胞亚群，能够分泌产生多种抑制性类型细胞因子，包括IL-10以及TGF-β等，且IL-10以及TGF-β均为免疫逃逸发生机制的重要因子。当Treg细胞分泌出IL-10以及TGF-β后，以上细胞因子会共同发挥抑制作用，包括抑制效应细胞自身功能，产生颗粒酶以及穿孔素等对效应细胞进行杀伤，并干扰效应细胞自身正常代谢能力，以调节树突细胞方式对Treg细胞分化以及增殖等活动进行干扰，进而对机体免疫细胞发挥抑制其功能的作用。同时，本研究发现，高危型组外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及Th17/Treg细胞以及血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均较低危型组高，提示HPV感染的危险程度也与机体的免疫细胞及细胞炎症因子存在关联，考虑与Th17与Treg细胞等的数目失调有关。

HPV感染引发宫颈病变主要分两个阶段，分别为宫颈HPV于患者机体内免疫逃避，并造成持续性感染，然后造成宫颈发生器质性病变[14，15]。目前已经证实，高危型HPV发生持续性感染是引起宫颈病变重要原因，并且通常情况下，浸润性宫颈癌与16以及18型HPV持续性感染密切相关[16]。同时，高危型HPV的E6及E7基因编码类型蛋白质为造成宫颈病变重要致病因素。通常Th17与Treg细胞二者之间存在一定平衡，如机体内此平衡遭到打破，则容易发生癌变。高、低危型HPV感染患者外周血Th17/Treg细胞、IL-17以及TGF-β水平差异均有统计学意义，且本研究还发现，外周血Th17/Treg细胞与IL-17、TGF-β、IL-23、宫颈病变程度以及HPV感染的危险分型均呈正相关。证实免疫细胞及炎症因子与宫颈病变及HPV感染密切相关。

综上所述，外周血内Th17/Treg细胞及炎症因子与宫颈癌变、HPV危险分型均有紧密联系，临床可考虑对此类指标进行监测，从而更好地辅助诊治。

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山东省科学技术厅科技计划项目(01-BS59)。

孙选(E-mail:sunxuan_1966@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.013

R

B

1002-266X(2017)29-0041-03

2017-04-05)