苹果MdAFS基因亚细胞定位表达载体的构建及分析

丁瑞瑞,王 露,王茹茹,刘 宇,张元湖*,成妮妮

1.山东农业大学 生命科学学院,山东 泰安 271018 2.临沂大学 生命科学学院,山东 临沂 276000

苹果MdAFS基因亚细胞定位表达载体的构建及分析

丁瑞瑞1,王 露1,王茹茹1,刘 宇1,张元湖1*,成妮妮2*

1.山东农业大学 生命科学学院,山东 泰安 271018 2.临沂大学 生命科学学院,山东 临沂 276000

为研究萜烯合酶亚细胞定位的改变对植物萜类及其生长发育特性的影响，以青香蕉苹果（Malus domesticaBorkh cv.White Winter Pearmain)果皮、菊花、酵母和拟南芥为材料，采用PCR技术分别克隆了α-法尼烯合酶基因(AFS)、Rubisco强启动子(Ru)、线粒体定位转运肽(Mit)与叶绿体定位转运肽(Pla)，并利用plantCARE软件和SignalP4.1Server网站对所得启动子和转运肽序列进行了预测分析。结果表明Ru序列具备强启动子特有的TATAbox、CAATbox以及多种相关的激素响应元件，且所得线粒体和叶绿体定位转运肽也均预测到转运肽的功能。利用所得的以上序列分别构建了由Ru强启动子驱动的线粒体和叶绿体定位的AFS基因表达载体，并成功转化获得了转基因烟草植株，实时荧光定量PCR表明目的基因在转基因植物中有较高的表达，并且存在空间表达特异性。

苹果;MdAFS基因;亚细胞;表达

萜类物质是一类重要的次生代谢物，其中具有挥发性的低分子量萜类在动植物种内及种间的信息交流中发挥了重要作用，如在植物在受到昆虫侵害时往往会有针对性的释放一组萜类物质，作为特异性的信号吸引其天敌进而起到间接防御的作用[1,2]。萜烯合酶是催化萜类物质合成的末端酶，依据其产物分子量的不同，其亚细胞定位也存在差异，如一般认为分子量较小的单萜（C10）是由定位于质体中的单萜合酶产生，而倍半萜（C15）则由细胞质定位的倍半萜合酶合成。近年来对萜烯合酶亚细胞定位的报道使人们对其定位部位有了新的认识，如发现质体中存在二萜的底物，将二萜合酶定位到细胞质中后也能够合成相应的二萜[3]，且产生的二萜含量往往较质体定位的更高；另一方面，由于萜烯合酶的产物不专一性，改变其亚细胞定位后通常伴随着其他新的萜类物质的产生[4]。有研究表明，将存在细胞质中的草莓的芳樟醇/橙花叔醇合酶定位到质体中后，不仅改变了其萜类产物的含量和种类，尤其是提高了芳樟醇的浓度，而且还影响到了防御蚜虫取食的行为[5]。同样将细胞质定位的β-法尼烯合酶定位到烟草线粒体中合成后不仅产生了大量β-法尼烯，还起到了转基因烟草对蚜虫的驱散作用[6]。

α-法尼烯是一种倍半萜类挥发性有机物，存在于苹果、梨、玉米、棉花、栀子花等多种植物中，是昆虫的诱导剂[7]和信息素[8]，在植物的防御中起重要作用，并且被认为与冷藏苹果和梨果实重大的生理病害—虎皮病的发生等有关[9]。定位在细胞质中的α-法尼烯合酶（AFS）是α-法尼烯合成途径中的关键酶与最终酶，直接影响α-法尼烯的产生，且研究表明其不仅具有倍半萜合酶的活性还具有单萜合酶的活性。

萜类合酶（TPS）在植物体内定位过表达或者阻断萜类的合成途径能够改变萜类合成的数量和种类，影响植物的生长生理特性。有研究表明过表达倍半萜合酶基因后酶产物量过低或难以测出，因此利用强启动子驱动并进行亚细胞定位研究有助于解决这一问题[4]。本实验克隆了苹果中α-法尼烯合酶基因，菊花中Rubisco强启动子以及拟南芥叶片中叶绿体定位肽与酵母菌中线粒体定位肽序列，构建表达载体，试图在烟草不同亚细胞部位过表达α-法尼烯合酶基因，为进一步研究萜烯合酶亚细胞定位对植物萜类物质及其生长发育特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

青香蕉苹果(Malus domesticaBorkh.cv.white winter pearmain）购于泰安郊区果园，菊花(Chrysanthemum morifolium）购买于花店，哥伦比亚型（Columbia）拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草NC89为本实验室保存。大肠杆菌E.coliDH5α与农杆菌菌株LBA4404由本实验保存，酿酒酵母，连接载体pMD18-T购自大连宝生物有限公司，真核表达载体pBI121（经过改造，含有SalI酶切位点）。TaqDNA聚合酶，DNAMarker，反转录试剂盒，定量试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，各种限制性内切酶，T4-DNA连接酶购自Fermentas公司，质粒小提和凝胶回收试剂盒购自天根生化科技公司，组织培养用的MS培养基，酵母膏蛋白胨培养基以及其它各种生化试剂均为国产的AR级试剂。

1.2 材料处理

T1代转基因烟草NC89种子经MS加卡那霉素培养基在25℃培养箱中筛选2周后移入培养室，培养条件为相对湿度50～60%，光照强度145mmol·m-2·s-1，光照条件为16 h光照/8 h黑暗。以植物幼苗叶片和盛花期不同器官（根、茎、叶、花）为试验材料取样，置于液氮中冷冻，–80℃冰箱保存备用。

1.3 基因的提取

利用Ultrapure RNAKit超纯RNA提取试剂盒（CWBIO）提取RNA，反转录得到第一链cDNA，存于–20℃冰箱作为基因克隆和实时荧光定量PCR的模板备用。CTAB微量法提取菊花或野生型拟南芥叶片基因组DNA。溶菌酶法提取酵母基因组。

1.4 引物设计

根据已知序列设计特异引物，PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。如表1所示。

1.5 构建载体

公司合成表1引物，进行PCR扩增:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 15 s，循环35次，72℃延伸10 min。取20mL反应液，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并存储照片。连接载体为pMD18-T，插入片段与载体的摩尔数比为3-10:1。4 ˚C条件下连接过夜，然后转化大肠杆菌。鉴定阳性的克隆送上海生工生物公司测序测序，Pla/Mit会有两种插入方向，通过测序或特异性引物与通用引物配对分别扩增来判断其插入方向，选择正向插入的重组载体。取PCR鉴定为阳性的单菌落，接种于LB（Amp+）液体培养基中，培养至对数生长期，提取质粒DNA。酶切、回收，将回收的片段利用前面的连接方法连接，转化，筛菌，测序，构建成克隆载体pMD18-T+Pla/Mit+AFS。和前面所述的方法类似，转化，筛菌，测序，将pBI121载体的35S启动子替换成Rubisco强启动子，构建成中间表达载体pBI121+Ru。质粒pBI121+Ru和pMD18-T+Pla/Mit+AFS的酶切。同样地，和前面所述的方法类似，转化，筛菌，测序，构建成真核表达载体pBI121+Ru+Pla/Mit+AFS。

1.6 农杆菌介导烟草转化

利用农杆菌介导法，将构建成真核表达载体pBI121+Ru+Pla/Mit+AFS转入烟草中，经过100 mg·L-1Kan抗性筛选后，PCR检测得到阳性转基因植株，进行后续试验。

1.7 实时荧光定量PCR分析

分别以T2代6个转基因株系叶片和盛花期的不同组织部位(根、茎、叶、花）为材料，利用Ultrapure RNAKit超纯RNA提取试剂盒（CWBIO）提取RNA，反转录得到第一链cDNA，存于–20℃冰箱保存，备用。

利用构建载体内参引物 18SF1：5¢-TTCCTAGTAAGCGCGAGTCATCAGC-3¢，18SR1：5¢-GCGACGGGCGGTGTGT-3¢和AFS定量引物 PaFSF：5¢-AAAGCGACAATCTCGGCACAA-3¢，PaFSR：5¢-GCGCGAAATGGTGGTTCTCTAAT-3¢，进行 qPCR 基因表达分析。

2 结果与分析

2.1 AFS、Ru强启动子、Mit和Pla的克隆

利用Ultrapure RNAKit超纯RNA提取试剂盒（CWBIO）从青香蕉苹果果皮中提取总RNA并反转录，CTAB小提法从菊花和拟南芥叶片中提取基因组DNA，溶菌酶法提取酵母菌基因组，分别用特异性引物RuFS1和RuFS2、Ru1和Ru2、PlasmidP1和PlasmidP2、MitP1和MitP2进行聚合酶链式反应（PCR）扩增AFS、Ru、Pla、Mit片段，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳，扩增片段大小与实际大小基本一致（图1）。回收PCR产物，连接pMD-18T克隆载体，转化大肠杆菌，利用菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性菌落，摇菌测序。测序结果显示，AFS、Ru、Mit与Pla基因序列片段长度分别为1780 bp、1100 bp、87 bp、156 bp。

图1 基因克隆电泳图Fig.1 Electrophoresis results of genes cloningMarker：DL2000 ladder；A：AFS扩增片段;B：Ru扩增片段；C：Mit扩增片段；D：Pla扩增片段。Marker:DL2000 ladder;A:Amplified fragment ofAFS;B:Amplified fragment ofRu;C:Amplified fragment ofMit;D:Amplified fragment ofPla

2.2 Ru、Mit和Pla序列预测分析

用DNAman软件将所扩增的片段与GeneBank注册的序列比对，并利用PlantCARE在线网站对Ru启动子序列进行预测分析。比对结果显示，AFS、Pla、Mit基因序列和注册的序列保持一致，Ru启动子序列与GeneBank注册的序列有个别碱基的不同，但用PlantCARE网站预测的结果显示所扩增的Ru序列具有特有的TATAbox和CAATbox以及多种相关的激素响应元件，具有强启动子的典型特征(图2）。利用SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对扩增的叶绿体和线粒体定位肽序列进行细胞定位预测(图3），从预测结果中可以看出，这两段定位肽均具有信号肽的功能。

图2 Ru启动子核苷酸序列预测Fig.2 Deduced nucleotide sequences ofRupromoter

图3 线粒体和叶绿体转运肽序列预测Fig.3 Deduced sequences of Mitochondria transit peptide and chloroplast signal peptideA：叶绿体定位肽；B：线粒体定位肽A:Targeting peptide of chloroplast;B:Targeting peptide of mitochondria

2.3 真核表达载体构建

将拟南芥中的叶绿体信号肽和酿酒酵母菌中的线粒体转运肽连接在AFS基因的上游，将AFS分别定位到烟草的叶绿体和线粒体中，再结合菊花中Rubisco的超强启动子来替换CaMV35S组成型启动子(图4），在烟草的不同部位（叶绿体和线粒体）超强表达AFS，最后经过双酶切反应和测序，结果证明真核表达载体构建成功。

图4 表达载体的构建图Fig.4 Construction of expression vector

2.4 qPCR分析不同转基因烟草株系中AFS的表达

对在转录水平鉴定为阳性的转基因植株，从T1代随机选取6个转基因株系，对AFS基因的相对表达量进行实时荧光定量PCR检测(图5）。qPCR也进一步证明法尼烯合酶基因在烟草中得以表达。本研究分别选取三个表达量最高的转基因植株（P1、P2、P3；M3、M4、M5）进行后续的实验研究。

图5 qPCR分析不同转基因烟草株系中AFS的表达Fig.5 Expression ofAFSin different transgenic tobacco strains by qPCRA：叶绿体过表达植株；B：线粒体过表达植株A:Chloroplast over-expression plants;B:Mitochondria over-expression plants

2.5 转基因植株AFS表达的空间特异性

为了检测在烟草叶绿体、线粒体超表达AFS在空间上表达，我们选取盛花期转基因株系，分别取根、茎、叶、花，利用qPCR对AFS的表达量进行定量测定。结果表明，在叶绿体中过表达AFS的转基因植株叶片中的AFS的表达量最高，根、茎、花中的表达量远远低于叶片，并且在这三种器官中AFS的表达量没有显著差异(图6，A）。在线粒体中过表达AFS的转基因植株，同样是在叶片中其表达量最高，但花、茎，根中的表达量与叶中差异不显著(图6，B）。线粒体与叶绿体中AFS表达含量相比较而言，叶绿体叶片中AFS的表达量约是线粒体叶片表达量的两倍，但花器官中线粒体AFS表达量却是叶绿体的四倍左右，其它部位差异不大。以上结果说明，在叶绿体和线粒体中过表达AFS的转基因植株中，AFS存在器官空间特异性表达，并且此表达与目的基因的区室化定位并没有直接关系。

3 讨论

倍半萜合酶利用FPP来合成C15倍半萜类化合物，一般认为倍半萜合酶定位于细胞质中[10]。有研究在细胞质过表达FaNES1基因并未测出产物芳樟醇和橙花叔醇，后将FaNES1在线粒体定位肽的作用下定位到线粒体中，其主要原因是由于线粒体是泛醌生物合成的场所并且拟南芥中具有包含线粒体定位肽的FPP合酶同源异构体[11,12]，发现不仅提高了产物芳樟醇和橙花叔醇的含量，而且改变了植物的生态效应[4]。Rubisco启动子转录活性比35S启动子强7～8倍[13]，因此我们尝试利用菊花的Rubisco小亚基基因超强启动子取代35S启动子驱动一种胞质定位的法尼烯合酶进行超表达，并通过融合特异的转运肽改变其作用区间至叶绿体和线粒体中，以研究该倍半萜合酶在表达量或表达亚细胞部位发生改变时对整个萜类代谢网络及相关生态效应的影响。

研究表明，合成萜类基因的表达通常具有时空特异性[14]。本研究通过构建Ru强启动子与目的基因及线粒体、叶绿体定位肽基因表达载体，成功转化烟草并获得了转基因植株,实时荧光定量PCR检测证明，α-法尼烯合酶基因存在组织特异性表达，并且在线粒体和叶绿体转基因植株中α-法尼烯合酶基因在叶中含量的表达最高，这将有助于进一步研究该基因的组织特异性功能。

最新研究发现，倍半萜法尼烯的还原产物法尼烷，由于其低吸湿性和能量密度被认为是新型生物燃料良好的生物前体，具有较高的燃烧效率，成为传统石油良好的替代品[15,16]，因此倍半萜法尼烯合酶的代谢过程具有重大的研究和应用价值。本实验室在后期试验将继续对转基因植株进行生理特性、抗逆性差异及可能的分子机制，深入研究该基因在萜类物质合成途径中的网络调控作用。

[1]Degenhardt J,Gershenzon J,Baldwin IT,et al.Attracting friends to feast on foes:engineering terpene emission to make crop plants more attractive to herbivore enemies[J].Current Opinion in Biotechnology,2003,14(2):169-176

[2]Pichersky E,Gershenzon J.The formation and function of plant volatiles:perfumes for pollinator attraction and defense[J].Current Opinion in Plant Biology,2002,5(3):237-243

[3]Dong L,Miettinen K,Goedbloed M,et al.Characterization of two geraniol synthases from Valeriana officinalis and Lippia dulcis:similar activity but difference in subcellular localization[J].Metabolic engineering,2013,20:198-211

[4]Kappers IF,Aharoni A,van Herpen TWJM,et al.Genetic Engineering of Terpenoid Metabolism Attracts Bodyguards toArabidopsis[J].Science,2005,309(5743):2070-2072

[5]Aharoni A,Giri AP,Deuerlein S,et al.Terpenoid metabolism in wild-type and transgenic Arabidopsis plants[J].The Plant Cell,2003,15(12):2866-2884

[6]Bhatia V,Maisnam J,Jain A,et al.Aphid-repellent pheromone E-β-farnesene is generated in transgenic Arabidopsis thaliana over-expressing farnesyl diphosphate synthase 2[J].Annals of botany,2014:250

[7]Yan F,Bengtsson M,Makranczy G,et al.Roles ofα-Farnesene in the Behaviors of Codling Moth Females[J].Zeitschrift fur Naturforschung C,2003,58(1-2):113-118

[8]Morgan C,Thomas RE,Ma W,et al.Melanocortin-5 receptor deficiency reduces a pheromonal signal for aggression in male mice[J].Chemical senses,2004,29(2):111-115

[9]Huelin FE,Murray KE.α-Farnesene in the natural coating of apples[J].Nature,1966,210:1260-1261

[10]Turner G,Gershenzon J,Nielson EE,et al.Limonene Synthase,the Enzyme Responsible for Monoterpene Biosynthesis in Peppermint,Is Localized to Leucoplasts of Oil Gland Secretory Cells1[J].Plant Physiology,1999,120(3):879–886

[11]Cunillera N,Arro M,Delourme D,etal.Arabidopsisthaliana ContainsTwo Differentially Expressed Farnesyl-Diphosphate Synthase Genes[J].J Biol Chem,1996,271(13):7774–7780

[12]Cunillera N,Boronat A,Ferrer A.The Arabidopsis thalianaFPS1Gene Generates a Novel mRNA That Encodes a Mitochondrial Farnesyl-diphosphate Synthase Isoform[J].J Biol Chem,1997,272(24):15381-15388

[13]Outchkourov NS,Peters J,De Jong J,et al.The promoter-terminator of chrysanthemum rbcS1 directs very high expression levels in plants[J].Planta,2003,216(6):1003-1012

[14]Nagegowda DA.Plant volatile terpeniod metabolism:Biosynthetic genes,transcriptional regulation and subcellular compartment[J].FEBS Letters,2010,584(14):2965-2973

[15]Peralta-Yahya PP,Ouellet M,Chan R,et al.Identification and microbial production of a terpene-based advanced biofuel[J].Nature Communications,2011(2):483

[16]Wang C,Yoon SH,Jang HJ,et al.Metabolic engineering ofEscherichia colifor alpha-farnesene production[J].Metab Eng,2011,13(6):648-655

Construction and Analysis of AppleMdAFSGene Expression Vector into Different Subcellular Compartments

DINGRui-rui1,WANGLu1,WANGRu-ru1,LIUYu1,ZHANGYuan-hu1*,CHENGNi-ni2*
1.College of Life Sciences/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China
2.College of Life Sciences/Linyi University,Linyi276000,China

To study the change of terpene synthase subcellular localization influenced terpenoids metabolism and plant development,we used the White winter pearmain peels,Chrysanthemum morifolium,Yeast and Arabidopsis thalianas as experimental materials and cloned the strong promoter of alpha-Farnesene synthase,Rubisco,transit peptide of mitochondria(mit)and transit peptide of chloroplast(pla)by RT-PCR.Then the sequence of promoter and transit peptide were predicted by PlantCARE and SignalP4.1Server.The results showed thatRuhad typical characteristics of strong promoter elements(TATAbox,CAATbox and hormone response elements)and both ofmitandplamaybe have the function of transit peptide.We have successfully constructed the alpha-Farnesene synthasegene expression vector in different subcellular localization driven byrubiscostrong promoter,and transformed them into tobacco.Quantitative real-time PCR showed that the gene had a higher expression and was tissue-specific in transgenic tobacco.

Apple;MdAFSgene;subcellular;expression

S661.1

A

1000-2324(2017)04-0576-06

2015-12-10

2016-01-11

国家自然科学基金项目(31370359)

丁瑞瑞(1990-),女,在读硕士研究生,主要从事植物次生代谢与分子调控.E-mail:ruidingc@163.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:yhzhang9@163.com;chengnn2002@163.com