一株产纤维素酶菌株的鉴定及其产酶条件优化

李 杨,桓明辉,高晓梅,刘晓辉,敖 静,朱巍巍,池景良

辽宁省微生物科学研究院,辽宁 朝阳 122000

一株产纤维素酶菌株的鉴定及其产酶条件优化

李 杨,桓明辉,高晓梅,刘晓辉,敖 静,朱巍巍,池景良

辽宁省微生物科学研究院,辽宁 朝阳 122000

从土壤中筛选出一株产纤维素酶的细菌，编号为X-2。该菌株为革兰氏阳性菌，好氧，可生成芽孢。根据其菌体形态、菌落形态、生理生化特征作为初步分类依据，并通过16S rDNA分子生物学鉴定的技术手段，鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。液体发酵试验表明，其产酶的最适条件为：发酵时间为72 h，培养温度35°C，转速130 rpm、接种量6%以及初始pH 7.2，在该条件下其羟甲基纤维素酶（CMCase）活性可达10.89 U/mL。

纤维素酶;鉴定;苏云金芽孢杆菌;产酶条件优化

纤维素是地球上数量最大的可再生能源物质，由于其存在很多的高能氢键难以水解，因此很难被人类或动物直接利用[1]。我国是农业大国，每年产玉米秸秆超过7亿t，玉米秸秆是一种纤维素含量很高的农作物废弃物，目前对玉米秸秆的处理大部分是丢弃或者焚烧，产生了严重的环境问题[2-4]。如何使玉米秸秆达到无害化和资源化利用已经成为目前研究的热点。利用微生物产生的纤维素酶作用于玉米秸秆，已经取得了一定的进展，具有效果稳定、降解彻底和降低污染的优点，因而得到了普遍的认可[5,6]。因此，筛选和分离出产纤维素酶的微生物菌株，提高其对纤维素的降解能力，研制出混合菌株的腐熟剂已经成为目前利用微生物降解玉米秸秆以及纤维素资源的开发利用的研究重点，同时对于解决能源危机和环境污染等具有重大的意义。纤维素酶是能够降解纤维素生成葡萄糖的一类酶的总称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系[7,8]。在纤维素资源的综合利用过程中，纤维素酶发挥重要作用。

过去的研究中，大多数报道的纤维素酶来源于丝状真菌，尤其是木霉属和曲霉属，由于这些菌株产纤维素酶种类多、产量高、性质多样，因此成为发酵法产纤维素酶的主要菌株[9,10]。近几年人们对产纤维素酶的细菌产生了浓厚的兴趣，因为细菌的一个最大优点是易于培养、生长周期和产酶周期短，生产过程中可以降低成本，同时可彻底降解天然纤维素，达到预想的效果。随着对细菌深入研究，一些新的可降解纤维素的好氧细菌菌种被发现和开发利用。本实验室从自然界中筛选出了一株好氧、生长速度快且产纤维素酶较高的细菌菌株X-2，鉴定为苏云金芽孢杆菌，对其进行了进一步分子生物学鉴定，通过测定菌株菌数和CMCase活力作为指标，优化其最适产酶条件，为后期深入研究该菌株的规模化生产奠定了基础，同时为微生物秸秆腐熟剂提供一株后备菌株。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

从土壤中分离一株产纤维素酶细菌，命名为X-2。

1 mg/mL葡萄糖标准溶液；3,5-二硝基水杨酸显色剂（DNS显色剂）；pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液；1%CMC-Na溶液。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基[11]。

液体发酵培养基：蛋白胨l0.0 g，酵母提取物l0.0 g，(NH4)2S042.0 g，KH2PO44.0 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g,CMC-Na l0.0 g，蒸馏水 l000 mL，pH7.2。

V-P培养基；甲基红（M.R.）培养基；明胶液化培养基；淀粉水解培养基；葡萄糖氧化发酵培养基（休和利夫森培养基）；柠檬酸盐利用培养基[12]。

甘露醇卵黄多粘素琼脂培养基（MYP）、胰酪胨大豆羊血琼脂基础培养基和无菌脱纤维羊血购于青岛海博生物技术有限公司。

1.3 菌种鉴定方法

1.3.1 形态学特征和生理生化试验 根据《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》[13,14]，对分离得到的菌株进行鉴定。

1.3.2 16S rDNA序列比对及系统发育分析 用细菌16 S rDNA的引物，即上游引物F：5′-CAGAGT TTGATCCTGGCT-3′，下游引物 R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，进行 16S rDNA 的扩增。扩增体系为：rTaq 酶(5 U/μL)12.5 μL，上游引物和下游引物（2.5 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 2 μL，最后加双蒸水至50 μL，混合后瞬间离心，置于PCR仪上98℃变性3 min，然后98℃变性25 s，5 5℃退火25 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min反应结束。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。委托上海生工进行测序。将测序结果输入GenBank进行同源性分析。利用Mega、Clustal等软件进行比对，构建进化树，重复次数为1000次。

1.4 产酶发酵条件优化

1.4.1 产CMCase的测定

1.4.1.1 刚果红平板法检测菌株产纤维素酶能力 将菌株接种于CMC-Na培养基平板上培养3 d，用0.1%的刚果红染色30 min后用1 M NaCl溶液洗脱，观察是否出现透明圈。

1.4.1.2 CMCase的测定

(1)粗酶液的制备：将发酵液于4°C、5000 rpm条件下离心l0 min，所得上清液即为粗酶液。

(2)葡萄糖标准曲线：取8支20 mL的具塞刻度试管，分别加入标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加入蒸馏水 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 mL，1.5 mL 的 DNS 显色剂，混合液摇匀后于沸水浴中煮沸5 min，迅速置于凉水中冷却，定容到l0 mL，摇匀，540 nm处测定吸光值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

(3)羧甲基纤维素酶活力（CMCase）的测定[15,16]。取4支试管编号。其中1-3号为反应管，4号为对照管。取0.5 mL粗酶液加入1-3号试管中，加入1%CMC-Na溶液1.5 mL；4号管中加入0.5 mL经高温灭活的粗酶液和1%CMC-Na溶液1.5 mL。将上述试管置于50°C水浴30 min，立即加入1.5 mL DNS显色剂终止反应。再将上述试管一同沸水浴5 min后，迅速冷却并定容至l0 mL，摇匀，540 nm波长处测定吸光度，记录各管的吸光值。

CMCase酶活力定义:在上述反应条件下,纤维素酶液每分钟催化底物1%CMC-Na溶液生成l μg葡萄糖所需酶量定义为一个酶活力单位（U）。

1.4.2 产酶发酵时间的优化 将菌株X-2接种到发酵培养基中，于30°C、130 rpm条件下培养24 h、36 h、48h、60 h、72 h、84 h及96 h后测发酵液在570 nm的OD值并测定CMCase活力，重复3次。

1.4.3 温度的优化 设25°C、30°C、35°C、40°C 4个温度条件，130 rpm振荡培养72 h后测发酵液的OD值和CMCase活力，重复3次。

1.4.4 接种量的优化 按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接种量接种，在35°C、130 rpm的条件下培养72 h后测发酵液的OD值和CMCase活力，重复3次。

1.4.5 转速的优化 设定摇床转速在100 rpm、130 rpm、150 rpm、180 rpm，于35°C培养72 h后测发酵液的OD值和CMCase活力，重复3次。

1.4.6 初始pH的优化 设定培养基初始pH为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0，于35°C、130 rpm培养72 h后测发酵液的OD值和CMCase活力，重复3次。

2 结果

2.1 形态学特征

对X-2细菌形态特征进行观察（表1），结果表明菌株X-2为革兰氏阳性菌，24 h后可形成稳定的菌落。X-2细菌菌体为杆状，侧生鞭毛，产中生芽孢。

表1 细菌X-2的形态观察Table 1 The morphological observation of X-2

2.2 生理生化反应

X-2菌生理生化反应见（表2）。根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》所列的芽孢杆菌属形态学和生理生化性状的描述，初步认为X-2为芽孢杆菌属（Bacillus）。

表2 细菌X-2生理生化性状鉴定Table 2 Identification of X-2 physiological and biochemical characters

2.3 PCR反应扩增后各菌株的16 S rDNA片断

从图1可以看出，得到的扩增产物的分子量在1500 bp左右，符合16 S rDNA片断大小，说明该扩增片断是16S rDNA片断。

图1 细菌X-2的16 S rDNA M 泳道为marker，点样量为5 μLFig.1 16 s rDNA of X-2 M lane was marker,sample dosage was 5 μL

2.4 细菌X-2的16 S rDNA鉴定以及系统发育树的构建

测序测得16 S rDNA大部分序列为1494 bp。登陆NCBI，使用BLAST在线将得到的16 S rDNA序列提交进行BLAST在线分析。将测出的序列通过16 S rDNA序列同源性比较，X-2与Bacillus thuringiensis的16 S rDNA序列相似性均达到100%。根据同源性比较结果，可以初步确认细菌X-2为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

从Genbank中选择了11个菌株，应用Mega、Clustal软件进行多重比较后构建系统发育树。如图2所示，菌株X-2和苏云金芽孢杆菌在一个分支中，且菌株X-2与苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（FN433030.1）和Bacillus thuringiensis（GU471753.1）的亲缘关系较近。进一步证明菌株X-2为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

图2 细菌X-2基于16 S rDNA的系统进化树Fig.2 Phulogenetic tree of X-2 based on the 16 S rDNA sequence

2.5 葡萄糖标准曲线的绘制

不同含量的葡萄糖对应的吸光值和葡萄糖标准曲线如下所示。吸光值与葡萄糖含量成正比例关系，且R2=0.995，因此可以通过测定溶液的吸光值OD计算出相应的葡萄糖含量。

图3 葡萄糖标准曲线Fig.3 Standard carve of Glucose

2.6 菌株X-2产纤维素酶能力的测定

菌株培养3 d后，结果如图4。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，因此通过是否产生透明圈可以判定菌株是否产纤维素酶。测量X-2透明圈的直径（12.72±3 mm），D1/d1是3.24。故X-2是一株可以产纤维素酶的细菌。

图4 菌株X-2产纤维素酶的定性分析Fig.4 Qualitative analysis on CMCase of X-2

图5 培养时间对菌株X-2生长和产CMC酶的影响Fig.5 Culturing time effect on growth and CMCase of X-2

2.7 培养条件对生长速率和产酶量的影响

2.7.1 发酵时间对生长速率和产酶量的影响 结果如图5所示，接种后24 h内，菌株生长比较缓慢，24 h后菌株快速生长，培养72 h后发酵液OD值达最大，产酶量达到10.31 U/mL，为纤维素酶的最佳收获期。72 h后随着时间的延长，生长速率逐渐减小趋于平衡。由于养分的消耗和代谢产物的分泌，菌丝老龄化严重，慢慢解体，故发酵液的OD值有所下降。

2.7.2 发酵温度对生长速率和产酶量的影响 结果如图6所示，X-2在30～35°C代谢最旺盛，可见其最适生长温度为30～35°C。随着温度升高生长速率均受到抑制，说明培养温度对细菌X-2的CMCase影响效果显著。产酶量随着温度的升高呈上升趋势，在35°C时达到最高，超过35°C，随温度升高，酶活力有所下降。综合考虑其生长曲线和产酶能力，确定X-2最适宜的发酵产酶温度为35°C。

图6 发酵温度对菌株X-2生长和产CMC酶的影响Fig.6 Temperatures effects on growth and CMCase of X-2

图7 接种量对菌株X-2生长和产CMC酶的影响Fig.7 Inoculum effects on growth and CMCase of X-2

2.7.3 接种量对生长速率和产酶量的影响 结果表明，如图7，随着接种量的增加，菌株的生长代谢呈现较好状态，菌数和CMCase的酶活力均增加，OD值均均可达到1.00以上，接种量对细菌X-2生长的影响并不显著。但当接种量超过6%的时候，酶活力逐步下降，推测是由于接种量过多导致培养基中溶氧量不足的原因。综合生长速率和CMC酶活力确定X-2的最适接种量为6%。

2.7.4 转速对生长速率和产酶量的影响 由图8可以看出，当转速为100 rpm时，菌数和酶活力都较低，生长状况相对最好的转速条件是130 rpm和150 rpm，此时OD值分别为1.011和1.014。130、150和180 rpm转速条件下，菌株X-2的产纤维素酶能力差别不大，当转速在130 rpm时，其菌数和产纤维素酶能力相对偏高。综合考虑，菌株X-2的产酶发酵最佳转速确定为130 rpm。

图8 转速对菌株X-2生长和产CMC酶的影响Fig.8 Rotate speed effect on growth and CMCase of X-2

图9 pH对菌株X-2生长和产CMC酶的影响Fig.9 pH effect on growth and CMCase of X-2

2.7.5 初始pH对生长速率和产酶量的影响 从图9可以看出，初始pH对菌株X-2生长速率和酶活力均有显著影响。初始pH在6.5时OD值较低，随着初始pH的增加，OD值呈明显上升趋势。初始pH为7.2时，OD值达最高1.221，进一步增加而有所降低。初始pH在7.2～8.0的条件下，菌株X-2的产酶活性均可保持在一个较高的水平。在培养基初始pH为7.2、7.4时，CMCase分别达10.89 U/mL和10.72 U/mL。因此，菌株X-2的发酵培养最适pH为7.2。

3 讨论

纤维素是年产量巨大的可再生能源物质，通过微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径，也是多年来研究者的目标。已发现的具有降解纤维素能力的微生物有近200种，分布在真菌、细菌和放线菌中，其中以真菌类产纤维素酶为主[17-19]，但真菌产纤维素酶的规模生产较繁琐、周期长，在很大程度影响了纤维素的酶解效率，增大了生产成本[20,21]，因此筛选出一种周期短、产酶高的菌株至关重要。本试验对细菌菌株X-2进行了鉴定及产纤维素酶条件的优化。菌株X-2能产芽孢，革兰氏阳性，分子生物学鉴定其为苏云金芽孢杆菌。其最适产酶条件为:培养基起始pH值为7.2，发酵温度35°C，接种量为6%，转速为130 rpm，培养72 h，此条件下产CMCase可达10.89 U/mL。X-2在72 h即可达到产酶高峰，大大缩短了生产周期，且产纤维素酶量也较高，这与陈晨[22]等发现菌株F1即鉴定为苏云金芽孢杆菌后，其纤维素酶活在72 h可达到最高的研究一致。到目前为止，对Bacillus agaradhaerens、Bacillus cellulyticus、解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产纤维素酶研究比较深入，纤维素酶的纯化方法已经形成，超过20个编码纤维素降解酶的基因已经被测序和克隆[23]。X-2对纤维素具有较强的降解作用，本实验只是对其发酵条件进行了初步探索，下一步继续研究该菌株产纤维素酶的基因及其纤维素酶的性质，期望从基因水平上提高菌株的纤维素酶活，将其应用于微生物腐熟剂的制作过程中，为腐熟剂的复合菌种提供后备菌株，对环境和生态问题会有很大的应用前景和意义。

4 结论

(1)根据其菌体形态、菌落形态、生理生化特征作为初步分类依据，该菌株为革兰氏阳性菌，杆状，好氧，可生成芽孢。并通过16S rDNA分子生物学鉴定的技术手段，鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

(2)刚果红平板结果表明X-2是一株可以产纤维素酶的细菌，透明圈的直径（12.72±3 mm），D1/d1是3.24。

(3)液体发酵试验表明，其产酶的最适条件为：发酵时间为72 h，培养温度35°C，转速130 rpm、接种量6%以及初始pH7.2，在该条件下其羟甲基纤维素酶（CMCase）活性可达10.89 U/mL。

[1]张 勇,陶青燕.纤维素酶的应用进展[J].中国饲料,2002,18(4):17-19

[2]王巧兰,郭 刚,林范学.纤维素研究综述[J].湖北农业科学,2004(3):14-19

[3]辛亚平,昝林森,杜双田,等.降解纤维素菌株筛选及其鉴定[J].畜牧兽医杂志,2011,30(5):1-5

[4]赵方圆,范宁杰,朱建春,等.纤维素高效降解菌YN1的筛选及其降解特性[J].微生物学通报,2010,37(4):496-502

[5]刘春芬,贺稚非,蒲海燕,等.纤维素酶及应用现状[J].粮食与油脂,2004(l):15-17

[6]胡 月,刘 霞,雷 颉.高产纤维素酶青霉菌的筛选及产酶条件的研究[J].中国食品添加剂,2007,2(l):80-84

[7]张传富,顾文杰,彭科峰,等.微生物纤维素酶的研究现状[J].生物信息学,2007,5(1):34-36

[8]周俊强,邱忠平,韩云平,等.纤维素降解菌的筛选及其产酶特性[J].环境工程学报,2010(3):705-708

[9]Johann O,Teinar RBB.Phylogenetic and Pysiological studies of FourHydrogen-Producing Thermoanareobes from Icelandic Geothermal areas[J].IcelandieAgri.Sei,2007,20:93-105

[10]Hari S,Krishna K,Selthar C.Studies on the Production and application of cellulose from Trichoderma reesei QM-9414[J].BioProcess.Eng,2000(22):467-470

[11]张建强,李亚澜,李 勇.纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件[J].西南交通大学学报,2006,41(4):442-446

[12]沈 萍,范秀荣,李广武.微生物学实验[M].3版.北京:高等教育出版社,1999:214-222

[13]布坎南RE,吉本斯NE.伯杰氏细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社,1984:62-65

[14]东秀珠,蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:62-63

[15]齐 云,袁月祥,陈 飞,等.一组纤维素分解菌的分离、筛选及其产酶条件的研究[J].天然产物研究与开发,2003,15(6):510-512

[16]刘德海,杨玉华,安明理,等.纤维素酶酶活的测定方法[J].中国饲料,2002,17:27-28

[17]杨礼富,谢贵水,王真辉,等.木质纤维素酶高产菌株的筛选和鉴定[J].热带作物学报,2001,22(3):70-77

[18]马旭光,张宗舟,蔺海明,等.黑曲霉高产纤维素酶活突变株的筛选[J].中国酿造,2008,9:61-63

[19]赵连娣,孟顺利,史兆国,等.绿色木霉液态发酵产纤维素酶条件的优化[J].浙江农业学报,2015,27(3):442-447

[20]陈丽燕,张光祥,黄春萍,等.两株高产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及酶学特性[J].微生物学通报,2011,38(4):531-538

[21]黄 艳,覃拥灵,凌 敏,等.不同碳源诱导康氏木霉产纤维素酶的研究[J].中国酿造,2008,15(8):41-44

[22]陈 晨,解玉红,冯 炘,等.纤维素降解菌的分离及单菌株与菌群纤维素酶活性质[J].天津理工大学学报,2012,28(4-5):62-65

[23]Lin Ling,Kan Xianzhao,Yan Hao,et al.Characterization of extracellular cellulose-degrading enzymes fromBacillus thuringiensisstrains[J/OL].Electronic journal of biotechnology,2012,15(3).http://www.scielo.cl/scielo.ph p?pid=S0717-34582012000300002&script=sci_arttext&tlng=p

Identification for a Strain of Produce Cellulase and Enzyme ProductionConditionsOptimization

LI Yang,HUAN Ming-hui,GAO Xiao-mei,LIU Xiao-hui,AO Jing,ZHU Wei-wei,CHI Jing-liang
Microbial Research Institute of Liaoning Province,Chaoyang122000,China

This paper screened a strain of cellulose-producing bacteria No.X-2 from the soil.It was an aerobic Gram-positive bacteria and able to generate spore.It had been identified asBacillus thuringiensisin laboratory according to thallus morphology,Colony morphology,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA molecular biology identification.Liquid fermentation test showed that Optimum fermentation conditions of X-2 were 72 h fermentation time,incubation temperature at 35°C,130 rpm of revolving speed,6%of inoculum size and pH7.2 of the initial value.The activity of hydroxymethyl cellulase(CMCase)under this condition reached 10.89 U/mL.

Cellulase;identification;Bacillus thuringiensis;optimization of fermentation conditions

Q93-331

A

1000-2324(2017)04-0556-06

2015-11-09

2015-12-03

国家农业科技成果转化资金项目(2013GB2B000093)

李 杨(1982-),女,硕士研究生,助理研究员,主要从事农业微生物生理生化方面研究.E-mail:liyang_0223@163.com